宋佳苋 朱敏

摘要：为探究环状GMP-AMP合成酶（cyclic GMP-AMP synthetase，cGAS）翻译后修饰参与DNA损伤应答的潜在作用，转染HeLa细胞和HEK-293T细胞，设置未处理组和Etoposide处理组。基于Western blot和免疫荧光染色，确定HeLa细胞质粒转染效率、Etoposide处理前后的DNA损伤效果、DNA损伤前后cGAS的细胞定位情况。采用免疫共沉淀和Western blot检测HEK-293T细胞cGAS的表达及UFMylation修饰。实验结果显示，HeLa细胞稳定表达cGAS，Etoposide处理可造成明显DNA损伤，未处理組cGAS富集于细胞质，处理组cGAS富集于细胞核。HEK-293T细胞稳定表达转染质粒，同时发现UFMylation修饰的cGAS。因此，cGAS参与DNA损伤应答且可能通过UFMylation修饰调控，为翻译后修饰视角研究DNA损伤应答提供理论参考。

关键词：DNA损伤应答；环状GMP-AMP合成酶；泛素折叠修饰因子1；UFMylation修饰

中图分类号：Q527 文献标志码：A

文章编号：1006-1037（2023）02-0020-04

doi：10.3969/j.issn.1006-1037.2023.02.04

基金项目：

国家自然科学基金（批准号：32201061）资助；山东省自然科学基金（批准号：ZR2021QC083）资助。

通信作者：

朱敏，女，博士，副教授，主要研究方向为DNA损伤修复。

先天免疫系统（快速感知和响应感染）和DNA损伤应答（DNA damage response，DDR）作为保持生物体完整性所必需的重要系统，其缺陷导致感染、自身免疫、癌症和衰老等诸多疾病，两者之间串扰所涉及分子因素及潜在机制仍不清楚。DDR能发现且控制细胞内特定DNA损伤，通过修复、耐受、永久失活（不可修复或不可耐受的病变细胞）等方式保护细胞，最大程度降低DNA损伤影响［1-2］。研究发现，12％的转移性癌症患者具有肿瘤抑制基因病原种系突变，其中75％与DNA损伤修复有关［3］。癌症发生是由多因素诱发、多基因参与且涉及基因突变和染色体变化的多阶段复杂过程，其核心特征之一是基因组不稳定性［4-6］。环状GMP-AMP合成酶（cyclic GMP-AMP synthetase，cGAS）是一种胞质DNA感受器蛋白，通过识别、结合细胞质内双链DNA（内源性和/或外源性）被激活，合成第二信使cyclic GMP-AMP（cGAMP），由cGAMP激活定位于内质网的干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING），进而触发信号级联激活天然免疫。虽然cGAS的激活可通过多种蛋白质翻译后修饰（Post-translational modification，PTM）调节，包括磷酸化、谷氨酰化、泛素化、SUMO化和乙酰化，但cGAS的其他PTM因子仍然知之甚少。Ub样蛋白（UBL）通过一系列酶促反应共价偶联其靶蛋白，如神经前体细胞表达和发育下调8（NEDD8）、干扰素刺激基因15（ISG15）和泛素折叠修饰因子1（UFM1）。UFM1作为新发现的UBL之一，与泛素化类似，通过三步酶促反应与其靶蛋白偶联，包含泛素样修饰剂激活酶5（UBA5， E1），UFM1偶联酶1（UFC1， E2），UFM1特异性连接酶1（UFL1， E3）。DNA损伤相关基因组不稳定性导致微核形成，微核cGAS与DNA损伤标志物如磷酸化的组蛋白H2AX（γH2AX）可共定位［7-8］。已有研究表明，DNA损伤以importin-α依赖方式诱导cGAS入核，通过多聚（ADP-核糖）与PARP1相互作用，抑制PARP1-Timeless复合物形成，从而抑制同源重组修复［9］。细胞核cGAS通过与染色质结合促进其致密化，阻碍RAD51介导的DNA链侵入，抑制同源重组修复［10］。综上，本文基于微核cGAS的作用，过表达HeLa细胞和HEK-293T细胞的cGAS，研究cGAS的UFMylation修饰及DNA损伤前后cGAS的细胞定位，为DNA损伤修复研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HEK-293T细胞系、HeLa细胞系源自ATCC细胞库。DMEM/HIGH-GLUCOSE（山东思科捷生物技术有限公司），胎牛血清（德国PAN-Biotech公司），HA Tag抗体（美国Bethyl公司），FLAG Tag抗体（美国Sigma公司），Protein A beads（美国GE Healthcare公司），γ-H2AX抗体（美国Millipore公司），FLAG-Vector、FLAG-cGAS、HA-UFM1、HA-UFM1（ΔC2）质粒均由本课题组实验室前期构建。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 HeLa细胞、HEK-293T细胞均接种于DMEM高糖细胞培养液（含10%胎牛血清、0.5%青霉素—链霉素混合液），置于37 ℃细胞培养箱（5% CO2）内培养。处于对数生长期的细胞通过胰酶消化后，参照聚乙烯亚胺说明书转染。

1.2.2 Western blot检测质粒转染效率 HeLa细胞（计数1.5×105个）接种至六孔板，于四孔分别转染FLAG-Vector、FLAG-Vector、FLAG-cGAS、FLAG-cGAS质粒各2 μg，转染48 h后，取一组FLAG-Vector、FLAG-cGAS质粒转染的细胞用25 μmol/L Etoposide处理2 h。吸除细胞培养液，加入100 μL sample buffer（含细胞裂解成分）裂解细胞，提取细胞全蛋白。采用10% SDS-PAGE胶分离蛋白，转印PVDF膜，经4%脱脂牛奶封闭后，加入FLAG Tag抗体4 ℃孵育过夜。次日，用抗鼠二抗室温孵育PVDF膜1 h，通过化学发光仪器检测信号，确定质粒转染效率。

1.2.3 免疫荧光确定cGAS细胞定位 HeLa细胞（计数1.5×105个）接种至六孔板（预置洁净玻片），于四孔分别转染FLAG-Vector、FLAG-Vector、FLAG-cGAS、FLAG-cGAS质粒各2 μg，记为a、b、c、d组。转染48 h后，a、c组不作处理，b、d组用25 μmol/L Etoposide处理2 h；剩余两孔记为m、n组，均不作转染处理，n组与b、d组同时用25 μmol/L Etoposide处理2 h。各组样本经4％多聚甲醛固定15 min，0.1% Triton X-100处理10 min通透细胞膜，10%山羊血清封闭1 h，分别滴加FLAG Tag一抗（a-d组）和γ-H2AX一抗（m-n组）4 ℃孵育过夜后，室温避光孵育荧光二抗（与一抗种属对应）2 h。加1滴含DAPI的抗淬灭封片剂至载玻片，覆盖细胞爬片，涂抹指甲油固定。通过荧光显微镜观察γ-H2AX（DNA损伤Marker）和cGAS的细胞定位情况。

1.2.4 免疫共沉淀确定cGAS的UFMylation修饰 HEK-293T细胞（计数7×106个）接种至10 cm细胞培养皿，记为e、f、g组，分别转染FLAG-VEC+HA-UFM1、FLAG-cGAS＋HA-UFM1、FLAG-cGAS＋HA-UFM1（ΔC2）质粒（质粒用量为：2.5 μg+2.5 μg）。转染48 h后，室温条件下用100 μL UF buffer（150 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0; 5% SDS; 30% Grycerol）裂解细胞30 min，100 ℃煮沸5 min，冷却至室温加入900 μL UF buffer A（50 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0; 150 mmol/L NaCl; 0.5% NP-40; 1×PIC）冰浴裂解30 min。14000 rpm，4 ℃离心10 min。取上清液，加入UF buffer A（上清液体积稀释一倍）， FLAG Tag抗体，过夜孵育后，加入Protein A beads结合2 h，提取FLAG Tag抗体特异性免疫沉淀蛋白，确定cGAS是否可以发生UFMylation修饰。

2 结果

2.1 DNA损伤后诱导cGAS从细胞质转位至细胞核

为确定DNA损伤前后cGAS的细胞定位，HeLa细胞经质粒转染后作部分DNA损伤处理，通过免疫荧光染色观察Etoposide处理前后cGAS的荧光信号。由图1可知，Etoposide处理的HeLa细胞发现DNA损伤Marker γ-H2AX于细胞核富集，而未处理细胞无明显γ-H2AX富集，即25 μmol/L Etoposide处理2 h可造成明显的HeLa细胞DNA损伤。HeLa细胞转染后的免疫荧光染色结果显示，未加药处理组细胞的cGAS主要定位细胞质中，这与其作为胞质DNA感受器参与先天免疫的功能一致（图1（c））。Etoposide诱导DNA损伤后，cGAS主要定位细胞核中，说明DNA损伤后cGAS发生了核转位，细胞核定位的cGAS可能参与损伤后DNA修复过程。

2.2 cGAS能被UFMylation修饰

cGAS的酶活性受多种PTM调节，为验证cGAS能否发生UFMylation修饰，免疫共沉淀纯化FLAG-cGAS蛋白并通过Western blot检测修饰情况。由图2可知，HEK-293T细胞中FLAG-cGAS可稳定表达，同时发现UFMylation修饰的cGAS（泳道2、3），其中UFM1（ΔC2）为暴露C末端甘氨酸残基的活性状态（泳道3）。这证实外源转入cGAS和UFM1后，与活性状态的UFM1（ΔC2）一致，cGAS可发生UFMylation修饰。

3 讨论

遗传信息传递过程中各种内源性和/或外源性因素会诱发DNA组成、结构异常改变从而影响基因组稳定性。内源性因素主要包括DNA错误复制，DNA不稳定性引发的自身碱基转化、碱基丢失、碱基修饰，以及由细胞正常代谢产生且使DNA碱基氧化、DNA链断裂的自由基［11-13］。据统计，细胞每天最多可发生105次内源性DNA损伤［14］。电离辐射、紫外线、化学诱变剂等物理化学因素引发的DNA损伤，会破坏碱基结构，形成嘧啶二聚体，产生DNA链断裂（SSB、DSB）和DNA交联（链内交联、链间交联、ICL）［15-17］。

正常细胞的胞质DNA积累受限于不同亚细胞位点的DNA酶作用，DNA酶存在于细胞外（DNase I和DNase IL3）、吞噬溶酶体内（DNase II）或胞浆内（DNase III），共同预防自身DNA异常累积［18］。研究表明，MutLα亚基缺失MLH1（其缺陷引发约50%的dMMR癌症）会导致DNA双链断裂，形成异常DNA修复中间产物，最终产生染色体异常，釋放核DNA，激活cGAS-STING途径［19］。经典cGAS-STING信号通路中，cGAS的酶活性受翻译后修饰调节，进而影响先天免疫反应。单纯疱疹病毒-1感染细胞时，RNF185（E3泛素化连接酶）通过介导cGAS（K173和K384位点）K27连接的泛素链形成，会增强cGAS的酶活性，促进下游干扰素应答效应［20］。UFMylation修饰参与内质网应激、胚胎发育、DNA损伤修复等多种生物过程。DNA双链断裂招募磷酸化的UFL1，通过UFMylation修饰单链组蛋白H4，增强募集SUV39H1和Tip60，从而促进DNA损伤时共济失调毛细血管扩张突变（ATM）激酶的激活［21］。此外，MRE11 K282位点的UFMylation修饰通过募集MRN复合物，激活ATM，从而促进同源重组介导的双链断裂修复，维护基因组稳定性［22］。本研究结果证实，细胞内cGAS存在UFMylation修饰，25 μmol/L Etoposide处理后细胞质定位的cGAS富集于细胞核，即DNA损伤后cGAS发生核转位，联结先天免疫和DNA损伤，为阐明两者之间串扰的分子机制，提供理论参考。

4 結论

cGAS-STING信号通路主要响应源自微生物、DNA病毒的外源DNA，以及由于基因组不稳定或线粒体释放的内源DNA，触发先天免疫反应，释放I型干扰素。研究结果表明，cGAS细胞质定位与先天免疫中功能一致。而Etoposide处理造成DNA损伤后，cGAS移位至细胞核，提示cGAS参与DNA损伤后修复过程。细胞内cGAS的UFMylation修饰，为探究cGAS参与DNA损伤修复的翻译后修饰调控提供新靶点。

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