李隽永,谢金利,邱琼华,毛桂福,张新林,韦 倩,梁学政*

(1.柳州市中医医院/柳州市壮医医院 药学部,广西 柳州 545001;2.柳州市中药(壮瑶药)制剂研发重点实验室,广西 柳州 545001;3.柳州市中药(壮瑶药)制剂开发工程技术研究中心,广西 柳州 545001;4.柳州市质量检验检测研究中心,广西 柳州 545001)

外感止咳露是我院常用的医院制剂,由防风、前胡、桔梗、苦杏仁、甘草、荆芥、薄荷等多味药材组成,具有疏风清热、止咳化痰的功效,临床上常用于风热咳嗽、咳痰、头痛、咽痛等,疗效较好,广泛用于本院及医联体单位,使用量大。由于该制剂已有20多年历史,初申报时质量标准简单,鉴别项为简单的理化鉴别,缺乏专属性,同时也缺乏含量测定项目,难以满足当下日益严格的药品监管和生产质量监控要求。为保证患者用药的安全、有效,使产品质量有据可依,需要对其质量标准进行提升。本研究通过对外感止咳露中防风、前胡、薄荷进行薄层色谱(TLC)鉴别;以甘草酸为参照,建立了5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷和甘草酸含量测定的HPLC“一测多评”法[1-3],旨在达到全面控制产品质量的目的,为提高外感止咳露的质量标准提供科学依据。

1 材料

1.1 主要仪器

紫外分析仪(齐威仪器有限公司)、超声清洗仪(昆山超声仪器有限公司)、高效液相色谱仪(日本岛津,LC-20AT[SPD-M20A])、高效液相色谱仪(日本岛津,LC-20AT[SPD-20A])、e2695高效液相色谱仪(Waters)、紫外可见分光光度计(岛津,UV-2450)、电子分析天平(瑞士梅特勒,XS205DU)、电子分析天平(瑞士梅特勒,AE200)、超纯水器(普析,GWB-2E)。

1.2 药品与试剂

薄荷脑(批号110728-201707)、白花前胡甲素(批号200113),购于中国食品药品检定研究院;升麻素苷(批号MUST-20022711,含量:98.42%)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(批号MUST-20050410,含量99.91%)、甘草酸(批号MUST-20042407,含量:99.50%),购于成都曼斯特有限公司;薄层板(青岛海洋化工有限公司);乙腈、甲醇为色谱纯(弗顿);外感止咳露(每瓶装250mL,批号20200201、20201101、20201201、20210102、20210103、20210201),由柳州市中医医院(柳州市壮医医院)制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 防风 取外感止咳露50mL浓缩至20mL,加正丁醇20mL萃取2次。正丁醇液合并蒸干,加乙醇1mL制成供试品溶液[4-5]。用乙醇溶解升麻素苷对照品,制成1mg·mL-1的对照品溶液。按外感止咳露处方工艺,制备成缺防风的阴性试样,按上述样品处理方法同法处理制成阴性对照溶液。取供试品溶液4μL、升麻素苷对照品溶液2μL、阴性对照溶液4μL点于硅胶薄层板GF254,展开剂为三氯甲烷-甲醇(8∶2),最后在紫外灯254nm下检视。供试品色谱与对照品色谱在相同位置上显同样的蓝紫色荧光斑点,阴性未见干扰。见图1。

注:1.外感止咳露(20200201);2.外感止咳露(20201101);3.外感止咳露(20201201);4.升麻素苷对照品(批号MUST-20022711);5.缺防风阴性样品。

2.1.2 前胡 取外感止咳露30mL以乙酸乙酯50mL萃取,萃取液蒸干后加甲醇1mL制成供试品溶液[6]。用甲醇溶解白花前胡甲素对照品,制成1mg·mL-1的对照品溶液。按外感止咳露处方工艺,制备成缺前胡的阴性试样,按上述样品处理方法同法处理,制成阴性对照溶液。取供试品溶液10μL、对照品溶液2μL、阴性对照溶液10μL点于硅胶G薄层板,展开剂为三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮(10∶1∶1),最后喷以20%高氯酸乙醇溶液,热风吹干后在紫外灯365nm下检视。供试品色谱与对照品色谱在相同位置上显同样的荧光斑点,阴性未见干扰。见图2。

注:1.外感止咳露(20200201);2.外感止咳露(20201101);3.外感止咳露(20201201);4.白花前胡甲素对照品(批号200113);5.缺前胡阴性样品。

2.1.3 薄荷 取外感止咳露250mL,提取挥发油,取提取出的油水混合物,用石油醚(60～90℃)20mL萃取2次,石油醚液合并自然挥干至1mL,制成供试品溶液[7]。用石油醚(60～90℃)溶解薄荷脑对照品,制成2mg·mL-1的对照品溶液。按外感止咳露处方工艺,制备成缺薄荷的阴性试样,按上述样品处理方法同法处理,制成阴性对照溶液。取供试品溶液5μL、对照品溶液8μL、阴性对照溶液5μL点于硅胶G薄层板,展开剂为环己烷-乙酸乙酯(10∶3),最后喷以1%香草醛硫酸溶液-乙醇(1∶4)的混合液,在105℃加热至斑点清晰。供试品色谱与对照品色谱在相同的位置上显同样颜色的斑点,阴性未见干扰。见图3。

注:1.外感止咳露(20200201);2.外感止咳露(20201101);3.外感止咳露(20201201);4.薄荷脑对照品(批号110728-201707);5.缺薄荷阴性样品。

2.2 HPLC一测多评法测定升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸的含量

2.2.1 色谱条件 Welch Ultimate AQ-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸水(B),梯度洗脱:0～15min,15%(A);15～20min,15%～20%(A);20～30min,20%～30%(A);30～35min,25%～30%(A);35～40min,30%～42%(A);40～50min,42%(A);50～55min,42%～15%(A);55～60min,15%(A);体积流量1mL·min-1;测定波长为254nm;柱温30℃;进样量10μL。

2.2.2 混合对照品溶液制备 分别精密称取5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸对照品适量,以甲醇溶解并定容,即得混合对照溶液(5-O-甲基维斯阿米醇苷107.0μg·mL-1、升麻素苷123.5μg·mL-1、甘草酸263.4μg·mL-1)。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取供试品溶液5mL至50mL量瓶中,加水稀释至刻度,过滤即得。

2.2.4 阴性对照溶液制备 按外感止咳露处方工艺制成缺防风和缺甘草的阴性试样;按“2.1.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.2.5 系统适应性与专属性考察 取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μL,进样分析,结果见图4。5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸的分离度均>1.5,各色谱峰的理论塔板数均在10 000以上。阴性对照无干扰,说明所用方法专属性良好。

注:1.升麻素苷;2.5-O-甲基维斯阿米醇苷;3.甘草酸。1.prim-O-glucosylcimifugin;2.5-O-methylvisammioside;3.glycyrrhizic acid。

2.2.6 线性关系、检测限与定量限考察 将混合对照品溶液制成6个不同浓度的系列标准对照品溶液,进样测定。以峰面积为纵坐标(Y),对照品质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(X),进行线性回归。分别取3种对照品溶液逐步稀释进样,以S/N=3时的浓度为检测限,以S/N=10时的浓度作为定量限。见表1。

表1 3种成分的线性关系

2.2.7 精密度试验 吸取供试品溶液(批号20210201),进样6次,记录峰面积。5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸峰面积的RSD分别为0.96%、0.46%、1.31%,表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 吸取供试品溶液(批号20210201),间隔0、4、8、12、24、36h 进样,记录峰面积。5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸峰面积的RSD分别为0.11%、0.10%、0.19%,表明稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 取同一批样品(批号20210201),分别制成6份供试品溶液,进样。5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸含量的RSD分别为1.26%、1.67%、0.29%。

2.2.10 加样回收率试验 取样品(批号20210201)溶液9份,每份2.5mL,分成3组,每组3份,分别添加5-O-甲基维斯阿米醇苷70.62μg·mL-1、升麻素苷148.20μg·mL-1、甘草酸237.20μg·mL-1的混合对照品溶液2.0、2.5、3.0mL,按照“2.1.3”项下方法制备成供试品溶液,进样测定,并分别计算回收率。5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸的回收率分别为100.7%、97.3%、103.2%,RSD分别为2.68%、2.63%、1.37%,表明试验回收率良好。

2.2.11 相对校正因子(fk/s)的计算 采用多点校正法,最终fk/s以6个不同质量浓度点的fk/s平均值确定。

计算公式为fk/s=(Cs×Ak)/(Ck×As)

Ck′=(Cs×Ak′)/(fk/s×As)

Cs:参照物质量浓度

As:参照物峰面积

Ck:其他对照成分质量浓度

Ak:其他对照成分峰面积

Ak′:待测成分峰面积

得出甘草酸与5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷相对的fk/s。结果见表2。升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的fk/s分别为3.229、3.286,RSD分别为0.18%、0.09%。

表2 以甘草酸为参照的fk/s(多点校正法)

2.2.12fk/s的重现性考察 本研究考察了3套色谱系统(LC-20AT(SPD-M20A)、LC-20AT(SPD-20A)、Waters e2695)和4根不同色谱柱(Welch Ultimate AQ-C18、Orca C8、Welchrom-C18、Agilent-C18)对fk/s的影响,结果见表3。显示不同仪器和不同色谱柱对升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的fk/s影响较小,说明该fk/s有良好的重现性。

表3 不同仪器和不同色谱柱下的fk/s

2.2.13 待测组分色谱峰的定位 以甘草酸为基准峰,计算5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷在不同色谱柱和不同仪器下的相对保留时间,结果见表4。表4显示不同色谱柱和不同仪器下的各色谱峰相对保留时间变化较小,RSD均<3.0%,表明本方法利用甘草酸来定位升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的色谱峰,具有可行性。

表4 不同色谱柱和不同仪器下的各色谱峰相对保留时间

2.2.14 一测多评法与外标法测定结果比较 分别用外标法和一测多评法进样测定,计算其含量,结果见表5。结果显示,使用外标法和一测多评法测定升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量,其结果差异较小,RSD均<2.0%,即以甘草酸为参照,使用一测多评法测定升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的方法,具有可行性,且准确度较高。

表5 外感止咳露中3种成分不同方法定量测定结果 (RSD<3%)

3 讨论

3.1 TLC鉴别

外感止咳露配制工艺中,对薄荷、荆芥的挥发油进行了单独提取,挥发油是外感止咳露疏散风热、利咽止咳的重要起效物质[8-9],其含有的薄荷脑能发挥清凉镇咳、抗病毒等作用。通过文献研究发现,薄荷和荆芥之间并不存在阴性干扰[10],因此选择薄荷中的薄荷脑作为一个鉴别指标。防风具有解热、镇痛、抗炎作用[11];前胡具有祛痰、镇咳、平喘等作用[12],两者均为外感止咳露中的君药,故选择薄荷、防风、前胡作为TLC鉴别项,具有代表性。

本研究对各TLC鉴别均进行了系统耐用性考察,考察了不同厂家的薄层板(自制薄层板、青岛海洋薄层板)、不同点样量、不同点样方式(圆点状、条状)、不同温度(4℃、25℃)、不同湿度(32%、60%、88%)。结果显示,各TLC鉴别在各条件下斑点清晰,各阴性对照均未出现干扰。

3.2 含量测定

本研究采用HPLC一测多评法测定5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸的含量,将水、甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙醚作为提取溶剂进行考察。结果显示,三氯甲烷、乙醚提取效率最差,水、甲醇和乙醇提取效果差异不大,为节约成本,故选择以水为溶剂。采用190～400nm进行全波长扫描,结果显示,5-O-甲基维斯阿米醇苷和升麻素苷在254nm处有最大吸收峰,甘草酸在254nm处吸收峰也较大,故选定254nm作为检测波长。在流动相的选择上,考察了乙腈-水体系和甲醇-水体系等不同流动相对供试品的分离效果,结果显示,使用乙腈-0.05%磷酸水溶液进行梯度洗脱,各成分分离效果好,且洗脱出的成分多。

本研究选取君药防风中的5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷作为指标成分,这是因为现代药理学研究显示,防风中的5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷具有显著的解热、镇痛、抗炎、抗菌、调节身体免疫功能等作用[13-14],是本制剂发挥疗效的主要成分,而甘草中的甘草酸具有的抗炎、抗病毒[15-16]等作用,也与制剂功效息息相关,故选择此三者作为该制剂的指标成分。一测多评法的使用,使多个成分检测化繁为简,节约了检验成本。本研究以甘草酸作为参照物,建立一测多评法测定各成分含量,所测结果与外标法测定结果具有较高的一致性,可信度高,说明可以运用一测多评法测定该制剂中3个有效成分的含量。

本研究通过TLC法和HPLC一测多评法建立了外感止咳露的质量标准,有助于较全面地监控制剂质量。