方茂霖 李兆萍 王蕴琪 杨文涛 周磊 李群生

精索静脉曲张是造成男性不育症的主要原因,以左侧发病为主,精索静脉曲张可使睾丸灌注减少,进而导致了睾丸体积下降、精液质量异常、睾丸生精功能异常的发生,最终对患者的生育功能造成了影响[1-3]。精索静脉曲张的主要病理表现为间质性水肿、睾丸组织内生精细胞脱落、微血管病变等,微小RNA-210(miR-210)是一种在缺氧相关疾病、肿瘤细胞、正常细胞中表达存在显著差异的缺氧因子之一,miR-210对微血管的形成具有促进作用,进而促进了精索静脉曲张患者病情的发展[4]。基于上述背景,本文研究中分析了下调miR-210对精索静脉曲张大鼠干预效果及作用机制,以期望为后续临床及实验研究提供理论依据。报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选取44只SPF级Wistar雄性大鼠,体重150～200 g,由中科中山药物创新研究院提供,动物许可证号:SYXK(粤)2020-0239,本次试验操作参照动物试验伦理要求的相关规定,且经我院伦理委员会批准同意。

1.2 方法

1.2.1 分组与建模:选取44只大鼠,12只作为假手术组,其余32只参照刘建国等[5]的方法建立精索静脉曲张模型作为精索静脉曲张模型组,对左肾静脉、左肾总静脉之间交通支进行部分结扎,假手术组只进行左肾静脉分离,不结扎,所有大鼠在术后给予肌内注射青霉素钠预防感染,剂量为20万U/d,共注射3 d,喂食标准饲料,喂养48周后,每组取2只进行剖腹观察,通过游标卡尺对大鼠左侧精索静脉直径进行测量,观察其曲张程度,大鼠左侧精索内静脉直径比与假手术组扩张2倍,双肾大小无明显差异,左肾无缺血萎缩等明显病变即为建模成功。建模成功后将精索静脉曲张模型组剩余30只大鼠分为模型组、上调组、下调组,每组10只。

1.2.2 miR-210转染:将所购买的miR-210模拟物(miR-210 mimic,上调)、miR-210抑制物(miR-210 inhibitor,下调)利用Lippofectamine 2000试剂盒稀释为5 mmol/L,将稀释后的miR-210模拟物、miR-210抑制物分别注射于上调组、下调组大鼠胃组织中,假手术组、模型组注射同剂量的蒸馏水灌胃,注射24 h后观察大鼠变化。

1.3 观察指标

1.3.1 病理学形态学观察:于miR-210转染后,每组取2只大鼠麻醉后处死,获取大鼠附睾组织,经脱水、石蜡包埋处理后,做HE染色,光镜下观察病理形态改变。

1.3.2 miR-210转染效率鉴定:于miR-210转染后,每组取2只大鼠麻醉后处死, miR-210转染效率经通过实时荧光定量法进行鉴定,提取造膜侧睾丸组织总RNA,使用Takara逆转录试剂盒将组织中的RNA逆转录为cDNA,采用Primer 5.0软件设计引物序列,启动PCR仪,反应体系:0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYBGreen,加蒸馏水至20 μl。反应条件:97℃预热8 min、95℃变性5 s、60℃退火31 s,共进行40个循环,采用2-ΔΔCt方法计算出 miR-210的表达量。miR-210上游引物序列:5’-CTGGAGCTGTGCGTGTGACAGC-3’,下游引物序列:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;内参GAPDH上游引物序列:5’-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3’,下游引物序列:5’-GGATCTCGCTCCTGGAAGATG-3’。

1.3.3 精液质量检测:按照WHO《人类精液及精子-宫颈黏液互相作用实验室检验手册(第四版)》标准对精子质量进行检测[6]。于miR-210转染后,断颈处死4组大鼠,迅速取左侧附睾,剪碎,溶于8 ml 0.9氯化钠溶液,37℃继续孵育15 min直至精子完全游出,获得精子悬液,滴到精子计数板上对4组大鼠精子浓度、精子活率进行检测。

1.3.4 氧化应激指标水平检测:于miR-210转染后,取大鼠睾丸组织越1 mm3,加入适量(1∶10)组织蛋白抽离液,充分碾碎,在半径3 cm,转速3 000 r/min的条件下离心15 min,提取上清液,0℃保存待测,采用黄嘌呤氧化酶法对4组大鼠超氧化物歧化酶(SOD)水平进行检测,通过TBA法对4组大鼠丙二醛(MDA)水平进行检测。

1.3.5 Nrf2/HO-1信号通路相对表达量检测:通过Western Blot方法对睾丸组织中的Nrf2/HO-1信号通路蛋白核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)相对表达量进行检测,将4组大鼠睾丸组织剪碎后加入裂解液,进行30 min裂解,以离心半径3 cm,转速3 000 r/min离心处理10 min,取上清液,做BCA(bicinchoninic acid)蛋白定性检测,将样品上样至8% SDS-PAGE凝胶上,经电泳后转移至PVDF膜上,用PBS封闭2 h后,加入TBST稀释的羊抗鼠 Nrf2、HO-1(1∶2 500)一抗,后4℃条件下孵育过夜,洗膜3次,加入1∶10 000的稀释羊抗鼠二抗,温室孵育1 h,做TBST洗膜3次,以β-actin为内参照,定量分析蛋白表达情况,重复试验3次。鼠源性一抗由上海嵘崴达实业有限公司提供。

2 结果

2.1 精索静脉曲张模型建模成功的判定 光镜下观察,假手术组大鼠生精小管内生精上皮层数完整,小管形态饱满,生精细胞排列有序,精索静脉曲张模型组大鼠的生精小管内生精上皮明显变薄,并且大量生精细胞缺失。见图1。

图1 光镜下病理切片对照(HE染色×200)

2.2 病理特征比较 光镜下,假手术组大鼠各生精小管排列有序、结构正常,各级细胞层次整齐光镜下,且清晰,未观测到明显形态异常,模型组生精小管内各级生精细胞层次较为紊乱,管腔内有少量精子存在,并且部分细胞结构不同程度受损;上调组大鼠的生精小管管腔缩窄,腔内少见正常精子,生精小管内各级生精细胞大量缺失,且脱落现象严重;下调组生精小管腔壁有明显扩大,一部分生精小管恢复正常管腔内可见多数正常精子。见图2。

图2 病理特征比较(HE染色×200)

2.3 miR-210转染效率鉴定 与假手术组相比,模型组、上调组、下调组miR-210表达量上升,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,下调组miR-210表达量下降,上调组miR-210表达量上升,差异有统计学意义(P<0.05);与上调组相比,下调组miR-210表达量下降,说明转染成功。见表1。

表1 miR-210转染效率鉴定 n=10,

2.4 4组大鼠精液质量比较 与假手术组相比,模型组、上调组、下调组精子浓度、精子活率水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,上调组精子浓度、精子活率水平下降,下调组精子浓度、精子活率水平上升,差异有统计学意义(P<0.05);与上调组相比,下调组组精子浓度、精子活率水平上升,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠精液质量比较 n=10,

2.5 4组大鼠氧化应激指标水平比较 与假手术组相比,模型组、上调组、下调组SOD水平下降,MDA水平上升,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,上调组SOD水平下降,MDA水平上升,下调组SOD水平上升,MDA水平下降,差异有统计学意义(P<0.05);与上调组相比,下调组SOD水平上升,MDA水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠氧化应激指标水平比较 n=10,

2.6 4组大鼠睾丸组织Nrf2/HO-1通路蛋白相对表达量 与假手术组相比,模型组、上调组、下调组Nrf2、HO-1相对表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,上调组Nrf2、HO-1相对表达量下降,下调组Nrf2、HO-1相对表达量上升,差异有统计学意义(P<0.05);与上调组相比,下调组组Nrf2、HO-1相对表达量上升(P<0.05)。见表4,图3。

表4 4组大鼠睾丸组织Nrf2/HO-1通路蛋白相对表达量 n=10,

图3 Nrf2/HO-1通路蛋白WB图

3 讨论

目前临床最主要通过药物、腹腔镜手术、显微外科手术、开放手术对精索静脉曲张患者进行治疗,药物虽然可使静脉回流增加,但整体治疗效果不佳,手术治疗患者术后可能出现血小板活化、聚集、黏附等现象,进而引发了轻微血栓、管壁炎症反应的发生,最终导致了精索静脉曲张复发或不良反应的出现[7,8]。研究显示,精索静脉曲张病情的发展与组织缺氧、氧化应激所导致的炎症、细胞凋亡存在密切联系,因此改善组组织缺氧及氧化应激反应对精索静脉曲张的治疗具有重要意义[9]。

miR-210在肿瘤形成、缺氧机制中发挥着重要作用,在缺氧时miR-210对DNA损伤、线粒体活动、细胞增殖具有抑制作用,在肿瘤发生机制中,miR-210一方面受HIF-1α的调控,另一方面miR-210可对HIF-1α进行调控,两者相互调节,进而使得两者的表达量增加,调节了机体的缺氧环境[10,11]。研究显示,miR-210、HIF-1α在精索静脉曲张睾丸组织中表达升高,可能与睾丸附睾损伤有关[12]。本文研究显示,下调miR-210可干预精索静脉曲张的病情发展,病理组织观察显示,经miR-210下调干预后大鼠生精小管腔壁有明显扩大,一部分生精小管恢复正常管腔内可见多数正常精子,此结果提示着下调miR-210可改善精索静脉曲张大鼠精液质量,其机制可能于组织缺氧改善,Nrf2/HO-1信号通路被激活有关。

精子密度、精子活动度是研究雄性生殖健康的重要指标,精子密度是影响生育的重要因素,当精子密度等于0时会造成无精子症的发生,精子活动度直接决定着精子是否可以正常游走到生殖管道与卵子进行结合,精索静脉曲张是影响精子发育和精液质量的主要疾病之一,患者精子密度、精子活动度会随之下降[13,14]。研究显示,反应活性氧、内源性促氧化因子表达过度可导致氧化应激的发生,同时反应活性氧的过度表达会造成附睾上皮细胞超微结构改变及功能障碍,最终引发了男性不育[15]。SOD可通过对多余反应活性氧的消除,进而起到了保护细胞的作用,阻止了精索静脉曲张病情的发展[16]。MDA是一种具有细胞独行的脂质过氧化终产物,可用于细胞质膜损伤程度的评价[17]。本文研究显示,精索静脉曲张可导致精子密度、精子活动度、SOD水平下降,MDA水平上升,经下调miR-210干预后上述指标改善,表明下调miR-210可抑制病情发展,改善精液质量。

Nrf2是一种具有抗癌、拮抗细胞凋亡、抗炎、维持细胞氧化还原平衡作用的转录因子,Nrf2在正常情况下可与特异性受体Keap1在细胞质中进行结合进而失去自身活性,在氧化应激反应刺激下Nrf2可从Keap1中解离,与抗氧化类反应元见进行结合,进而激活了HO-1等下游基因,最终使细胞的抗氧化能力得到增强[18,19]。HO-1可阻止游离血红素参与氧化反应,同时HO-1可与其酶解产物相互协作起到了抑制细胞凋亡、改善组织微循环、抗氧化、扩血管、抗炎的作用[20,21]。本文研究显示,Nrf2/HO-1通路蛋白相对表达量在精索静脉曲张发生后下降,经miR-210下调干预后,Nrf2/HO-1通路蛋白相对表达量上升,表明miR-210下调可能通过激活Nrf2/HO-1通路来抑制生精细胞凋亡,起到了阻止精索静脉曲张大鼠附睾组织损伤的作用,为精子的发育、成熟提供了有利条件。

虽然本文认为下调miR-210具有改善精索静脉曲张的作用,其作用机制可能与Nrf2/HO-1通路被激活相关,但仅为本文研究,未有研究分析其具体作用机制,因此上述研究需后续研究进一步分析验证。

综上所述,本文研究显示,精索静脉曲张发生后伴随精子密度、精子活动度水平下降,等表现,经下调miR-210干预后可改善上述情况,其机制可能与Nrf2/HO-1通路被激活有关。