王 文,陈新宇,黄兹艺,邓杨柳,崔红旺

骨折愈合是一个复杂且漫长的过程,多种生长因子和细胞炎症因子参与骨折的愈合过程,负责调节细胞活化和成骨细胞增殖[1-3]。研究[4]发现,NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain-associated protein 3,NRLP3)炎症小体不仅能激活炎症反应而且还参与了骨质疏松进展的调控,在延迟骨折愈合的过程中扮演重要角色。然而,其上下游的调控机制并不清楚。长非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一类大于200个核苷酸的非编码转录本家族[5],通过调节Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)和炎症小体密切参与骨折愈合的调控[6-8]。同源框D基因簇反义生长相关的长非编码RNA(homeobox D gene cluster antisense growth-associated long noncoding RNA,HAGLR)是一种关键的LncRNA[9-11]。已知HAGLR在股骨颈骨折中表达降低[12],但对胫骨骨折(tibial fracture,TF)的调控作用仍不清楚。该研究拟建立TF模型,探讨HAGLR对骨折的愈合作用和机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂 小鼠成骨细胞MC3T3-E1购于武汉普诺赛生命科技有限公司。DMEM培养基购于美国GIBCO公司;胎牛血清购于美国Merck Millipore公司;沉默HAGLR的阴性对照(si-NC)、沉默HAGLR的小干扰RNA载体(si-HAGLR)、pcDNA3.1空载体(pcDNA-null)、pcDNA3.1-HAGLR过表达载体(pcDNA-HAGLR)、短发夹RNA载体阴性对照(sh-NC)、沉默RUNX2的短发夹RNA载体(sh-RUNX2)构建于上海吉玛制药技术有限公司;NLRP3炎症小体抑制剂MCC950购于美国MCE公司;Lipofectamine 2000购于美国Thermo Fisher Scientific公司;CCK-8试剂盒、TUNEL染色试剂盒、RIPA 裂解缓冲液购于上海碧云天生物技术有限公司;TRIzol试剂购于美国Thermo Fisher Scientific公司;TransScript和cDNA合成试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司;Universal SYBR Green Fast qPCR Mix Kit购于美国ABclonal公司;GAPDH购于美国Cell Signaling Technology公司;HRP标记的亲和山羊抗兔鼠IgG(H+L)二抗购于美国Protein Tech Group公司;PVDF购于上海碧云天生物技术有限公司;RUNX2一抗、 p-RUNX2一抗、胰岛素样生长因……