李美妮,李永臻,汪明香,缪增强,双杰

皮肤是人体的第一道屏障,其屏障功能主要体现在防止皮肤水分流失,防止病原菌、病毒的侵入,防止物理化学性损伤等[1],人体皮肤老化的原因包括自然老化、压力、环境和遗传[2]。人皮肤真皮层主要由人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblasts,HSFs)及其分泌的基质构成,对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用,HSFs是皮肤衰老过程中的主要受损细胞之一[3]。

四氢嘧啶[(S)-2-methyl-1,4,5,6-tetrahydropyrimidine-4-carboxylic acid, ectoine]作为相容性溶质,1985年在嗜盐光合紫细菌盐绿需盐红螺菌 (Ectothiorhodospirahalochloris) 中首次发现并鉴定其结构[4],目前研究报道[5-7]四氢嘧啶已作为添加剂用于诸如保湿、抗衰老、防紫外线等功效的护肤品中。然而,针对于体外单一细胞实验中,四氢嘧啶抗HSFs衰老的细胞代谢机制、分子机理尚未阐明,本试验以体外培养的HSFs为研究对象,观察四氢嘧啶对HSFs相关衰老指标的影响,分析其能否减缓HSFs的衰老,探讨四氢嘧啶对抗衰老的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料和仪器 HSFs(上海中乔新舟生物科技有限公司,货号:2630)。 Trizol 试剂盒、细胞增殖活性检测试剂盒、β-半乳糖苷酶染色试剂盒、ROS试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),相关引物合成(上海生工生物技术公司),DMEM培养基(Gibco 公司,美国),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、DCFH-DA细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒、CO2培养箱(Thermo Scientific Forma 公司,美国),酶标仪(Bio-Rad 公司,美国),Insight-PlusIQ 型激光共聚焦显微镜(Meridian 公司,美国),荧光相差显微镜(北京荣兴光恒科技有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1HSFs的培养 HSFs复苏至含20% 胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基中,37 ℃、5% CO2细胞培养箱恒温培养,隔天换液,倒置荧光显微镜下观察细胞形态及生长状况,待细胞融合度达到80%～90%,取状态良好的细胞用于后续实验。

1.2.2四氢嘧啶处理细胞 待细胞传至第7代且汇合度达90%,用不含FBS的DMEM培养基饥饿处理细胞24 h后,对照组更换新的无四氢嘧啶培养基,实验组用不同浓度四氢嘧啶(0.50、1.50、2.50 μmol/L)作用24 h。收集细胞上清,提取细胞总RNA,保存于-80 ℃备用。

1.2.3细胞MTT活性检测 取对数生长期HSFs接种于96孔板,贴壁后加入不同浓度四氢嘧啶处理24 h,加入MTT和DMSO在全自动酶标仪波长568 nm下测定各孔吸光度(OD 值),细胞存活率=(OD实验组/OD对照组)×100%。

1.2.4β-半乳糖苷酶染色 取对数生长期的HSFs接种于6孔板,贴壁后加入不同浓度四氢嘧啶处理24 h,然后按β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书进行染色。

1.2.5细胞凋亡检测 使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒进行检测:加入 Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和 5 μL PI后在流式细胞仪上检测经过处理后细胞凋亡情况。

1.2.6细胞ROS检测 使用ROS试剂盒检测细胞内ROS水平。步骤均严格按说明书操作。

1.2.7荧光定量PCR 用RNA抽提试剂提取细胞总RNA, 经逆转录为cDNA后,以GAPDH为内参,引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成(引物序列见表1),按照荧光定量PCR反应程序进行扩增。

表1 引物序列及产物大小

1.3统计学处理 qPCR 结果采用2-ΔΔCT法,所得数值利用IBM SPSS22进行数据处理,采用 GraphPad Prism 5进行作图。多组之间比较采用单因素方差分析,两组之间比较采用独立样本t检验。以P<0.05视为差异有统计学意义,P<0.01视为差异极显著。

2 结果

2.1四氢嘧啶对HSFs 细胞活性的影响 MTT检测结果显示,经不同浓度四氢嘧啶处理,HSFs细胞增殖活力与对照组相比略有上升趋势,但差异无统计学意义(F=1.569,P>0.05)(图1),表明四氢嘧啶对HSFs并无毒害作用,可以进行后续实验。

图1 MTT法检测 HSFs 细胞的增殖活性 (n=3)

2.2四氢嘧啶对HSFs细胞衰老的影响 将不同浓度的四氢嘧啶作用于HSFs 24 h后,在倒置显微镜下观察SA-β-gal 法染色结果。结果显示,对照组(图2a)细胞碎片相对较多,且细胞间排列疏松。四氢嘧啶浓度组(图2b～2d)细胞碎片相对较少;细胞形态正常,呈典型的梭形,细胞形态较对照组更为规则;细胞密度大,细胞排列更加紧密,且随着四氢嘧啶浓度增加,细胞密度逐渐增大;观察结果提示,四氢嘧啶浓度组衰老细胞所占比例较对照组减少。

Control group; 0.50 μmol/L ectoine concentration group; 1.50 μmol/L ectoine concentration group; 2.50 μmol/L ectoine concentration group

2.3流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡 HSFs经四氢嘧啶处理后,用流式细胞仪测定细胞凋亡率。在流式细胞检测中,观察不同浓度的四氢嘧啶刺激HSFs凋亡的情况,流式细胞术检测各组HSFs凋亡的结果显示:四氢嘧啶处理组的HSFs凋亡率较对照组显著降低,与对照组凋亡率比较差异有统计学意义(F=233.20,P<0.01);且在本研究中,随着四氢嘧啶浓度的递增(0.50、1.50、2.50 μmol/L),HSFs凋亡率呈显著降低趋势,差异有统计学意义(F=199.81,P<0.01),见图3。

Note: Ectoine treatment group compared with the control group, **P<0.01,****P<0.000 1.

2.4四氢嘧啶对HSFs细胞ROS水平的影响 实验在保证细胞存活率95%以上的前提下,以DCFH-DA荧光探针法检测细胞内ROS水平变化,结果发现四氢嘧啶能明显清除细胞中的ROS,并且随着四氢嘧啶浓度的升高,HSFs的ROS活性逐渐被抑制,其中,2.50 μmol/L浓度的四氢嘧啶的ROS清除活性最强,见图4。

Note: Ectoine treatment group compared with the control group, ****P<0.000 1.

2.5各组HSFs细胞中p16、p21、p53 mRNA表达检测 结果显示,不同浓度四氢嘧啶处理均可下调HSFs细胞中衰老相关基因p16、p21、p53 mRNA的表达量。p16 mRNA的相对表达量,随四氢嘧啶浓度的增加而显著下调,与四氢嘧啶浓度呈负相关(F=65.20,P<0.05);1.50 μmol/L 四氢嘧啶浓度显著降低p21、p53 mRNA的表达水平(F=33.89、35.84,P<0.01),2.50 μmol/L 四氢嘧啶浓度作用组p16、p21、p53 mRNA相对表达量与对照组相比,差异有统计学意义(t=-14.47、9.28、9.78,P<0.000 1)。实验表明,四氢嘧啶对衰老相关分子p16、p21、p53基因的表达有一定的下调作用,见图5。

Note: Comparing the differences in p16, p21 and p53 mRNA expression between the cells in each group, ectoine treatment group compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01;***P<0.001,****P<0.000 1.

3 讨论

四氢嘧啶是嗜盐微生物提供给人类的一类宝贵的资源,其具有稳定蛋白质、核酸、生物膜以及整个细胞的功能,目前在生物保护、化妆品和生物制药等方面均具有应用潜力[8],但有关四氢嘧啶抗衰老的药理学研究鲜有报道。

本研究首先通过设置四氢嘧啶浓度梯度明确了其对HSFs无细胞毒性,这和既往的研究报道[8]是一致的。通过细胞周期检测,可以看到,四氢嘧啶可降低细胞凋亡率,这也表明,四氢嘧啶进入细胞后可参与细胞周期的调控,发挥关键作用。

在关于皮肤衰老机制的探索研究中,ROS作为线粒体有氧代谢电子传递链的副产物不断产生,除遗传因素外,ROS被认为是内源性衰老的主要原因[9],ROS能诱导并加速皮肤衰老过程,尽管少量ROS的存在已被证明在维持身体或细胞稳定方面发挥有益作用,如激活环加氧酶和脂氧合酶,调节炎症过程等[10-11]。同样,光老化的发生也与ROS的产生有关。紫外线可导致ROS增加,破坏细胞的结构和功能,并介导炎症反应[12-13]。目前已有一些天然植物提取物如千年草籽提取物等被报道对HSFs中ROS活性具有抑制作用从而延缓衰老[14]。但四氢嘧啶对HSFs氧化应激状态的影响尚未见报道,而本研究结果表明,四氢嘧啶可降低HSFs内ROS的水平,说明四氢嘧啶具有一定的抗氧化、清除自由基能力。

细胞衰老涉及多种机制和途径,而关于细胞老化相关蛋白的研究已比较透彻,细胞周期抑制蛋白p16、p21和p53是衰老相关通路中三个重要的信号分子,p53作为衰老的关键调节因子,在多种应激信号下可被激活,DNA双链断裂、端粒磨损均可通过活化p53,激活下游信号蛋白p16及p21等细胞周期激酶抑制剂,从而出现明显的细胞周期阻滞,导致细胞迅速出现老化特征[15-16]。值得注意的是,Buenger等[16]的研究发现,四氢嘧啶能够预防UVA诱导的第二信使释放、转录因子AP-2激活、细胞间黏附分子-1表达和线粒体DNA突变,从而提高皮肤的再生能力和延缓UVA引起的皮肤老化。本研究也以线粒体DNA为靶点探索了四氢嘧啶对衰老相关基因表达的影响,结果表明四氢嘧啶可下调衰老相关基因p16、p21、p53 mRNA表达,这与Buenger等[16]的报道有相似之处,均证实了线粒体DNA可作为四氢嘧啶抗皮肤细胞老化的作用靶点,不同的是,本研究中四氢嘧啶是通过调节线粒体DNA上细胞衰老相关因子p16、p21、p53的表达来延缓HSFs的复制性衰老。

综上所述,本研究通过检测四氢嘧啶对HSFs相关衰老指标的影响,发现其可能通过降低细胞凋亡率、细胞内ROS水平以及抑制细胞老化相关分子p16、p21、p53 mRNA表达来延缓衰老。这些结果均提示四氢嘧啶通过不同的分子机制对HSFs的衰老具有一定的减缓作用,但其具体机制仍有待深入研究。本研究为四氢嘧啶在体外单细胞中的抗皮肤老化领域提供了研究基础,提示四氢嘧啶可作为针对减缓HSFs衰老的有效成份,但其在抗皮肤衰老产品中的应用需要进一步研究。