王 兵,刘海峰,候惠娴,王春涛

(牡丹江医学院,黑龙江 牡丹江 157011)

肝纤维化是一种肝脏受到病理性损伤引起的疾病,其主要表现细胞外基质的过量产生和沉积,严重威胁人类健康。在肝纤维化过程中,转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)过量产生,进而与细胞膜表面的受体,包括转化生长因子β I型受体(Transforming growth factor-β receptor type I,TβRI)和II型受体(Transforming growth factor-β receptor type II,TβRII)相结合,引起TGF-β介导的信号转导,进而发挥其生物学功能[1]。具体表现为:首先与TβRII结合形成二聚体,活化的TβRII二聚体磷酸化TβRI,进而使其形成二聚体,最终形成异源四聚体,引起细胞内Smads和非Smads信号转导来引起细胞应答,其中SMAD蛋白是TGF-β1信号转导的的关键细胞效应因子[2]。

研究表明,在TGF-β介导的Smads途径中,包括促进型SMADs上升I型胶原蛋白表达、加快磷酸化和促进上皮-肌成纤维细胞转化。相反,抑制型SMADs可下调I型胶原蛋白的表达和抑制磷酸化和上皮-肌成纤维细胞转化。因而只包括TGF-β1结合区域而不含有激活下游信号转导的激酶区域的截短型转化生长因子β II型受体tTβRII可通过与野生型TβRII竞争结合过量的TGF-β1而弱化TGF-β1的促纤维化功能。课题组前期研究成功筛选tTβRII并验证其抗肝纤维化的疗效,tTβRII能延缓过程,但治疗效果不明显,针对肝纤维化,通过靶向PDGFβR,可以延缓病变发展,并提高治疗效果。

最近研究表明,在肝纤维化中活化的肝星状细胞表面血小板衍生生长因子β受体PDGFβR显著增加,因而成为区别纤维化和未纤维化的标志物[3]。另外,黄等人研究表明,PDGFβR的高亲和肽ZPDGFβR能高效特异性结合PDGFβR,因而ZPDGFβR修饰的tTβRII(Z-tTβRII)可通过ZPDGFβR靶向纤维化细胞而提高tTβRII的抗纤维化功能将是理想的靶向抗肝纤维化药物[4]。作为蛋白药物,获得高可溶性表达是降低蛋白药物成本的关键,可为其进一步研究和应用提供基础。因此本研究以Z-tTβRII为研究对象,探索在不同的温度、时间、浓度下,获得其在在大肠杆菌可溶性表达最佳的条件,为进一步靶向抗肝纤维化药物开发提供可能。

1 材料与方法

1.1 材料大肠杆菌Rossta/pET28-Z-tTβRII为牡丹江医药研究中心实验室保存。主要试剂IPTG和十二烷基硫酸钠购自于BioFroxx公司、三羟甲基氨基甲烷购自于Biosharp公司、卡纳霉素和30%制胶液购自于Solarbio公司、四甲基乙二胺购自于USB公司、蛋白胨和酵母购自于DXOID公司、氯化钠购自于天大化学试剂公司。

1.2 方法

1.2.1 重组蛋白全菌中表达 将单克隆阳性菌株Rossta/pET28-Z-tTβRII接种到4 mL卡那霉素抗性LB培养基(将0.04 g蛋白胨、0.04 g氯化钠和0.02 g酵母粉溶于4 mL三蒸水),37 ℃、200 r/min活化过夜。将活化菌按1%比例接入4 mL含卡那霉素抗性的LB培养基中,37 ℃、210 r/min培养至OD600值为0.6～0.8,加入终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG),进行诱导,以12 000 r/min,4 ℃离心10 min,弃上清液,收集菌体,SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳)分析重组蛋白的表达。IPTG对大肠杆菌的启动子有显著影响,大肠杆菌在LB培养基里,进行IPTG诱导使大肠杆菌表达大量相关蛋白质[5]。将对数生长期的菌株Rossta/pET28-Z-tTβRII加入适量IPTG后,经以下不同条件下诱导,即在16 ℃诱导18 h、在20 ℃诱导20 h、在37 ℃诱导6 h。收集菌体,用PBS重悬沉淀,冰浴超声波破碎(功率200 W,超声5 s,暂停5 s为1个循环,进行约3个循环)裂解菌体,分别取未诱导的全菌和诱导后的全菌进行SDS-PAGE分析[6]。蛋白的分子量可以通过与洗涤剂SDS相结合,根据蛋白的迁移距离来确定蛋白的分子量。

1.2.2 重组蛋白可溶性表达 将对数生长期的菌株Rossta/pET28-Z-tTβRII加入适量IPTG后,在不同温度下,即终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L IPTG加入于LB培养基中培养,经过诱导后,收集菌体,用PBS重悬沉淀,冰浴超声破碎裂解菌体,分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳)分析。在(16 ℃、18 h)、(20 ℃、20 h)、(37 ℃、6 h)比较0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L IPTG下,上清中可溶性蛋白表达,确定诱导浓度优化条件。

1.3 统计学分析重组蛋白在全菌中表达和可溶性表达实验均重复三次。使用Image J、GraphPad Prism 8.0.2进行统计学分析,定量资料用“平均值±标准差”表示。组间差异采用单向方差分析,采用Dunnett检验,P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 阳性菌株在16 ℃经不同IPTG浓度诱导18 h时Z-tTβRII的全菌表达将对数生长期的阳性菌株在16 ℃,添加四种终浓度不同IPTG(0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L)诱导培养18 h,SDS-PAGE结果表明,目的蛋白Z-tTβRII的分子量约为18 kDa,其在全菌中含量随着IPTG浓度增加逐渐增加,约占全菌蛋白的20%、19%、18%、22%左右,其中浓度为0.8 mmol/L IPTG时表达最高,如图1A、B示。进一步将全菌进行超声波破碎和SDS-PAGE,发现经超声破碎后,目的蛋白位于破碎后上清,提示目的蛋白得到可溶性表达,其可溶性表达的含量分别为11%、12%、10%、13%。通过图1C、D分析,在16 ℃,IPTG浓度为0.8 mmol/L诱导时,诱导后上清含量最高。

2.2 阳性菌株在20 ℃经不同IPTG浓度诱导20 h时Z-tTβRII的全菌表达SDS-PAGE结果表明,对数生长期的阳性菌株在20 ℃经0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L IPTG诱导20 h后,全菌中目的蛋白Z-tTβRII均得到不同程度的诱导表达,即随着IPTG浓度的增加,目的蛋白在全菌中表达逐步增加,约占全菌蛋白的21%、22%、22%、23%左右。其中在0.8 mmol/L IPTG条件下目的蛋白的含量最高,如图2A、B所示。进一步分析可溶性目的蛋白的表达,结果表明,可溶性目的蛋白的含量分别为14%、12%、10%、13%。通过图2C、D分析,在20 ℃,IPTG浓度为0.2 mmol/L诱导时,诱导后上清含量最高。

图1 诱导温度为16 ℃不同IPTG浓度时目的蛋白的全菌表达

图2 诱导温度为20 ℃不同IPTG浓度时目的蛋白的全菌表达

2.3 阳性菌株在37 ℃经不同IPTG浓度诱导6 h时Z-tTβRII的全菌表达SDS-PAGE结果表明,对数生长期的阳性菌株在37 ℃经0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L IPTG诱导6 h后,全菌目的蛋白Z-tTβRII得到大量表达,0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L IPTG下诱导后全菌目的蛋白表达约占全菌蛋白的30%、27%、26%、27%左右,其中0.2 mmol/L IPTG下诱导其目的蛋白含量最高,约占全菌蛋白的30%,如图3A、B所示。进一步将全菌超声破碎,发现可溶性蛋白表达含量分别为20%、16%、15%、14%。通过图3C、D分析,在37 ℃ IPTG浓度为0.2 mmol/L诱导时,诱导后上清含量最高。经过37 ℃诱导后,加入TPTG诱导后上清中目的蛋白均表达明显。综上所述,上清中可溶性目的蛋白Z-tTβRII 在37 ℃,0.2 mmol/L IPTG诱导时最高。

图3 诱导温度为37 ℃不同IPTG浓度时目的蛋白的表达

3 讨论

纤维化是一种主动的生物愈合反应,以保护器官组织受伤。当其脱离刺激时,会导致严重的器官损伤。在器官发生纤维化时,需要进行有效的药物治疗,防止肝脏进一步病变。器官纤维化主要细胞外基质的过度产生沉积,特别是I型胶原和纤维连接蛋白的沉积。然而器官经过长时间的损伤,其组织会发生纤维化,导致器官进一步的病变[7]。另外,纤维化疾病的反应细胞是肌成纤维细胞,此细胞类型的典型特点是:在受到损伤后,分泌大量的TGF-β,通过与受体TβRⅡ结合,进而激活下游的TGF-β/Smads和非TGF-β/Smads信号转导,从而分泌大量的ECM和胶原蛋白,造成ECM和胶原蛋白过多堆积和组织过度收缩,从而引起纤维化[8]。因而,器官纤维化产生的TGF-β1和过度激活的TGF-β1依赖性信号是ECM产生和沉积不均衡的原因。在TGF-β1介导的信号通路中,TβRII是形成TGF-β1/TβRII/TβRI三元复合物是关键作用受体。

目前,用于治疗纤维化的药物有很多种,然而,很多药物通过口服,经过血液循环并没有达到其特定的疗效。纤维化是慢性病患者发病和进一步恶化的主要原因,预防和逆转纤维化已成为临床药物实验的关键。其需要快速作用的药物来逆转纤维化,但现如今有效的药物,治疗效率缓慢,在治疗阶段疾病进一步进展,因此,需要高效和特异性的抗纤维化药物解决[9]。鉴于tTβRII可减弱纤维化过程中过度激活的TGF-β1与野生型TβRII(wtTβRII)的结合,同时PDGFβR在纤维化肝组织中过度表达[10],因此将tTβRII通过高亲和特异PDGFβR的介导作用,使其靶向纤维化组织,将是治疗和预防纤维化的一种新策略。由于获得大量具有功能性蛋白是其应用的前提,因此优化高亲和特异PDGFβR的Z偶联tTβRII(Z-tTβRII)将是理想的靶向抗肝纤维化蛋白药物,可高效发挥其疗效。另外由于大肠杆菌表达系统具有简单、高效等优点,已成为制备具有功能性蛋白(以可溶性形式存在)药物的理想表达系统。

大肠杆菌中诱导的温度、时间、IPTG浓度对所产生的蛋白分布具有重要影响,因此优化温度、时间、IPTG,获得最佳诱导条件,将是制备功能性蛋白的基础。因而本课题在相同温度和时间下,比较不同IPTG浓度对目的蛋白表达,以期获得适合目的蛋白表达的最佳条件。本实验经分析在不同温度下,即终浓度为(0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L IPTG)的诱导后全菌中目的蛋白,结果表明,Z-tTβRII在(16 ℃、18 h)、(20 ℃、20 h)、(37 ℃、6 h)[11]情况下进行诱导表达,在37 ℃、6 h下,Z-tTβRII在全菌中表达含量最高,约为30 %,因而最佳的诱导温度和时间分别为37 ℃和6 h;另外进一步收集菌体经超声破碎,分析目的蛋白的表达分布,结果发现,在0.2 mmol/L IPTG时,上清中目的蛋白含量最高约为20%。经优化重组Z-tTβRII的表达条件,获得其最佳诱导条件为在37 ℃和0.2 mmol/L IPTG诱导6 h。

综上所述,本实验获得的靶向抗纤维化蛋白药物Z-tTβRII在大肠杆菌中的最佳诱导条件,可以有效地促进蛋白质表达,提高蛋白质表达水平,进而为进一步开发靶向抗纤维化药物提供重要依据。此外,Z-tTβRII最佳诱导条件也可以用于对其他相关蛋白质进行有效表达,从而更好地揭示细胞调控机制,有助于认识细胞发育和活动状态,从而发现更多有效的抗纤维化药物。Z-tTβRII可以有效地调节蛋白质表达水平,降低表达纤维化系统的复杂性,促进蛋白质的生产,进而为获得功能目的蛋白提供可能,并为其应用提供可能。