闫 敏,荆文馨,林 强,,马 英,王 莹,宿海超,杨春壮

(牡丹江医学院 1.解剖教研室;2.附属红旗医院;3.图书馆,黑龙江 牡丹江 157011)

缺血性脑卒中(Ischemic Stroke,IS)是导致全球人口死亡和残疾的主要原因之一[1]。大多数IS患者将造成永久性神经损伤,其中约70%失去工作能力,40%遗留功能障碍[2]。这严重影响了个人健康,增加了家庭负担,增加了社会压力。FDA认可的IS治疗药物中只有组织纤溶酶原激活剂,但其治疗时间窗仅有4.5 h。只有大约不足10%患者能够在治疗时间窗内进行静脉溶栓治疗,超过此时间范围的治疗会大大增加出血性转化的概率[3]。网络药理学是以系统生物学为依托,以计算机技术为手段进行药物研究与开发,通过对药物与靶标、代谢产物、基因组、转录组和蛋白质组等信息等进行系统化的整合分析,揭示了药物的作用机理、对其药效性及副作用进行评价,展望新的治疗靶点,对药物研发具有方向性,有效性引导作用。分子对接属于计算化学技术的范畴,它的主要功能在于预测两分子间结合模式及相互作用力大小,为药物的研究与创新提供重要信息。在中国,中草药治疗IS已有数千年的历史[4]。刺芒柄花素(formononetin,FMT)是一种异黄酮类化合物,在中药材红车轴草、黄芪中分布较广[5-6]。其具有多种与治疗IS相关的药理活性,如抗氧化[7]、抗高血压[8]、促进血管生成[9]等。然而FMT对IS的保护作用及调控机制目前尚不明确。本课题以此为切入点,借助网络药理学、分子对接联合体内实验的方法探究FMT对MCAO大鼠的治疗作用及机制,以期为FMT治疗IS的基础研究提供新的思路,并进一步推动中草药的合理研发。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 48只7～8周龄、体重260～320 g的SPF级SD(Sprague Dawley)雄性大鼠,购自牡丹江医学院比较医学中心,动物许可证编号为SYXK(黑)2019-006。大鼠自由获得食物和水分,环境温度保持在25 ℃,空气相对湿度为50 %,模拟昼夜光照条件,饲养于牡丹江医学院比较医学中心(SCXK2019-003)。本研究的伦理审查号为IACUC-20200609-11。

1.1.2 药物及试剂 纯度≥98%的FMT、TTC染料(大连美仑生物公司MB1978-1、MB2599-1);大鼠TNF-、IL-1β、IL-6 ELISA 试剂盒(武汉CUSABOI公司Z23030100、Z21030198、Z22030199);P38、p-P38(Affinity公司AF6456、AF4001)、β-actin、HRP抗体(ABclonal公司AC026、AS014)。

1.1.3 仪器 恒温水浴锅(上海力辰科技公司HH-8)、小型蛋白电泳转移系统、超灵敏多功能成像仪(美国Bio-Rad公司#1658033、#1708265)、酶标仪(美国Molecular Devices公司M5e)

1.2 方法

(2)预测IS的疾病靶点 在GeneCards(https://www.genecards.org/)和DisGeNET(https://www.disgenet.org/)数据库中搜索疾病名称“ischemic stroke”获取相关基因。两者的筛选标准分别为Relevance score≥1、score≥0.1。将符合上述条件的基因结合起来,利用UniProt数据库统一名称,删除重复项后即为疾病靶点。

(3)获取药物-疾病治疗靶点 利用联川生物云平台(https://www.omicstudio.cn/tool)取药物和疾病靶点的交集并绘制Venn图。此交集内所包含的基因即为药物-疾病治疗靶点。

(4)构建蛋白-蛋白互作网络 将药物-疾病治疗靶点导入STRING数据库(Version:11.5,https://cn.string-db.org/)构建蛋白互作网络(protein-protein interaction,PPI)。在Cytoscape软件(Version:3.9.1)中画出其结果可视图,CytoNCA插件对网络进行了分析。筛选核心靶点条件为比中位数Degree大两倍。

(5)GO和KEGG富集分析 将核心靶点导入Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#)进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。其富集参数设置为Min Overlap:3、P Value Cut off:0.01、Min Enrichment:1.5。将KEGG和GO各项中排名前20的结果导入R软件中进行可视化展示。

1.2.2 分子对接验证FMT与蛋白的结合能力 蛋白质晶体结构从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)得到,然后通过Pymol软件对其进行去配体,去水和加氢预处理。在OpenBabel把FMT 3D结构的sdf格式文件转化为PDB格式的文件。在AutoDock(Version:1.5.7)软件中进行蛋白和FMT的分子对接,结果在Pymol中进行可视化处理。

1.2.3 动物实验 (1)大鼠的分组、给药及造模 将大鼠随机分为假手术组、模型组、FMT低、高剂量给药组(20 mg/kg、50 mg/kg),每组12只。各给药组分别腹腔注射对应浓度的药物,假手术组及模型组予等量生理盐水,每隔24 h给药一次,共给药7 d。参考改良Zea Longa[10]线栓法造模,方法如下:腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,颈部备皮消毒。在大鼠颈正中部做切口,分离周围组织,暴露右侧颈总动脉,颈总动脉单线备用,沿颈总动脉向远心端依次分离出颈外动脉、颈内动脉,翼颚动脉,并结扎翼颚动脉,保持颈总动脉的唯一分枝为颈内动脉。用手术线结扎颈外动脉两侧,用电凝枪将颈外动脉从中间截断。用止血夹夹闭颈总动脉,于预留出的颈外血管剪1个“V”形切口,插入尼龙线栓置入颈内动脉18～20 mm处,当明显感觉到有阻力感时,提示线栓已经栓在中动脉起始部位阻塞动脉,即停止插线栓。结扎颈外动脉上“V”形切口,松开颈总动脉上的止血夹。缝合伤口皮肤,等动物麻醉苏醒后放回笼中。除假手术组大鼠外,其余各组大鼠均进行造模术,假手术组除未置入线栓外剩下手术步骤与其余组一致。

(2)神经功能缺损评分 根据mNSS[11]评分标准对术后24 h大鼠的神经功能缺损程度进行评分。总分18分,分数越高,神经功能损害越严重。

经济发展水平(ED)：一般而言，工业化进程中经济发展水平越高，制造业结构越高级，本文使用人均国内生产总值(GDP)度量经济发展水平，其值越大，说明经济发展水平越高。

(3)大脑梗死状况的评估 取下脑组织后放入-20 ℃冰箱冷藏15 min。去除小脑后制厚2 mm冠状切片。脑组织浸泡于2%TTC的溶液中37 ℃染色15 min后,用4%多聚甲醛进行固定和照相。将图像导入ImageJ软件进行分析,计算脑梗死体积(%)=总脑梗死体积/总脑体积×100%。

(4)ELISA法检测大鼠血清中炎症因子的含量 取各组大鼠腹主动脉血,离心取上清液,严格按照大鼠TNF-、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒说明书中的步骤进行操作。

(5)Western Blot法检测脑组织中P38、p-P38蛋白的表达 取50 mg梗死区脑组织进行研磨后加入裂解液,12 000 r/min离心20 min后吸清液测定蛋白质浓度。将蛋白质在100 ℃的样品缓冲液中煮5 min。每孔加入30 μg蛋白质样品,经过SDS-PAGE凝胶电泳,转移到PVDF膜,用脱脂奶粉关闭1 h。在其加入一抗P38(1∶1 000)、p-P38(1∶1 000),4 ℃过夜,每10 min清洗一次膜,共3次后加入二抗(1∶5 000)孵育2 h,再以相同的间隔清洗3次膜,使用ECL试剂盒显影曝光。最后对其条带灰度值使用ImageJ进行分析。

1.3 统计方法实验数据使用SPSS 20.0软件处理分析,定量资料用“平均值±标准差”表示,多组间比较采用的方法是单因素方差分析,P<0.05表示两组差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物-疾病治疗靶点在TCMSP、SuperPred、SwissTargetPrediction、PharmMapper数据库中分别获得35、103、98、283个基因靶点,将其统一名称并去掉重复的后共得到492个药物靶点。在GeneCards、DisGeNET数据库中符合筛选条件的基因分别为126和2942个,统一去重后得到2957个疾病靶点。疾病和药物靶点取交集后得到133个药物-疾病治疗靶点,见图1。

图1 药物-疾病治疗靶点Venn图

2.2 PPI网络构建药物-疾病治疗靶点导入STRING数据库后获得一个含130个节点,827条边的网络图。Cytoscape软件进行PPI网络绘制并分析筛选得到23个核心靶点,见图2。

图2 PPI网络和核心靶点

2.3 功能富集分析GO富集分析结果表明23个核心靶点,参与的主要生物过程是细胞调控、小分子代谢调控、激酶调节、凋亡信号调节;涵盖主要细胞成分为细胞膜、转录调节复合体、神经元细胞体;涉及主要分子功能有转录因子结合、蛋白酶活化、蛋白激酶结合,见图3A。表明FMT可能通过上述方面影响IS的恢复。

KEGG富集分析得到83条通路,按P值从小到大排序,选前20进行展示,见图3B。排名前20的通路主要涉及到MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、C型凝集素受体信号通路、JAK-STAT信号通路、T细胞受体信号通路。结果表明FMT可能通过上述通路对IS发挥作用。

图3 GO和KEGG富集分析

2.4 分子对接结果预测FMT与核心靶点EGFR、MAPK14/P38、TNF-、KIT的结合能力,结合能小于-5 kcal/mol说明结合活性良好[12]。使用Pymol软件对其结果进行可视化,结果表明FMT与上述蛋白均有较好的结合活性,见表1和图4。

表1 FMT与核心靶点的结合情况表

图4 分子对接结果

2.5 FMT对大鼠神经功能的影响mNSS得分结果显示,假手术组大鼠未见神经功能缺损,模型组大鼠受损显著,模型组与假手术组比有显著差异(P<0.01);FMT治疗组与模型组相比,其评分显著下降(P<0.01);在FMT治疗组间,随着药物剂量的增加,大鼠神经功能缺损状况明显改善(P<0.01),见图5。

图5 FMT对大鼠神经功能的影响

2.6 FMT对大鼠脑组织梗死体积的影响TTC染色结果显示假手术组脑组织正常,无梗死区,而模型组脑梗死区呈白色,两组比较有显著性差异(P<0.01);FMT治疗组梗死区较模型组体积显著减小(P<0.01);在FMT治疗组间,随着药物剂量的增加,大鼠脑组织梗死体积明显减小(P<0.01),见图6。

图6 FMT对大鼠脑组织梗死体积的影响

2.7 FMT对大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影响Elisa试剂盒检测各组大鼠血清中的炎症因子含量发现,模型组与假手术组比TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著增加(P<0.01);而FMT治疗组与模型组相比其含量明显下降(P<0.01),见表2。

表2 FMT对大鼠血清中TNF-α,IL-1β,IL-6含量的影响

2.8 大鼠脑组织中P38、p-P38蛋白的表达Western Blot结果表明,各组大鼠脑组织中的P38蛋白含量无显著差别(P>0.05),但模型组脑组织中p-P38蛋白含量显著大于假手术组(P<0.01);FMT治疗组其含量小于模型组(P<0.05,P<0.01);而治疗组间随着药物剂量的增加,p-P38蛋白含量减小(P<0.05)。结果表明FMT对MCAO大鼠的治疗作用可能与P38/MAPK信号通路有关。

图7 FMT对各组大鼠脑组织中P38、p-P38蛋白的表达的影响

3 讨论

缺血性脑卒中在中医学体系中归属于“中风”范畴。中医对中风有成熟的认识和有效的治疗方法。但因中药有多组分、多途径、多靶点的功效特点,中药治疗比西药见效相对较慢,往往容易让人忽视[13]。随着测序技术日益成熟,中药具体作用机制的研究得以快速发展。本研究借助网络药理学、分子对接技术和体内实验探究中药单体FMT对IS的作用及机制。

通过检索药物、疾病数据库并进行后续分析得到23个FMT作用与IS的核心靶点。对核心靶点进行GO和KEGG富集分析,结果表明其功能主要集中在调节炎症反应、氧化应激反应、代谢反应及信号传导4个方面。涉及的主要信号通路,有以下作用。调节MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和JAK-STAT信号通路可以减轻炎症反应[14],减少神经细胞的凋亡[15-16],缓解血脑屏障损伤[17-18],并且PI3K-Akt信号通路还能减轻氧化应激反应,抑制神经细胞过渡自噬[19]。C型凝集素受体是IS的潜在候选标志物[20]。而T细胞受体与神经系统炎症密切相关[21]。基于MAPK信号通路作用的多样性及其在KEGG富集分析中的表现,我们选择此通路相关的核心靶点蛋白(MAPK14、EGFR、TNF-、KIT)与FMT进行分子对接,对接结果良好,因此我们推测FMT对IS大鼠的治疗作用可能与P38/MAPK信号通路有关。

为了验证预测的作用与机制,构建MCAO模型大鼠进行体内实验。实验结果表明,FMT能减轻IS大鼠的神经功能障碍,减小梗塞体积,降低炎症反应。我们进一步探究其机制,选择MAPK信号通路中的明星分子P38蛋白进行分析。P38 蛋白的磷酸化能够促进谷氨酸毒性从而诱导神经元凋亡[22];同时可以促进小胶质细胞中炎症因子的释放;抑制星形胶质细胞的凋亡,增加TNF-α,IL-1β,IL-6等炎症因子的释放,促进神经炎症反应的发生[23]。Western Blot实验结果显示,FMT可以降低IS大鼠脑组织中P38蛋白的磷酸化,且此作用随着药物浓度增大。此结果表明FMT的抗炎作用可能与P38/MAPK信号通路有关。

综上所述,本研究借助网路药理学、分子对接的方法确定了FMT对IS的作用靶点及机制,动物体内实验初步验证了FMT可通过P38/MAPK信号通路对IS发挥抗炎的作用。FMT对IS的治疗作用还在初期研究阶段,本研究仅开展了少量的体内实验,缺乏深入性探索,后期会在此方面提高,期望为IS的治疗提供新的思路。