王 妍,佟 雷,张 静,史嘉翊,代书景,陆 萌,石学魁

(1.牡丹江医学院,黑龙江 牡丹江 157011;2.新郑市人民医院检验科,河南 新郑 451100)

肠道微生态系统是人体最大的微生态系统,正常条件下,肠道菌群形成微生物屏障,提供能量和营养,保护肠道结构,维持肠道免疫稳态,抵抗病原菌入侵[1]。研究表明,外源性因素,特别是抗生素的过度使用能够破坏正常的微生物组成,发生菌群失调,致使肠道中出现新的耐药菌以及固有的耐药菌大量繁殖[2]。菌群失调也会使宿主肠道菌群对外界微生物抵抗力下降,进而引起肠炎、肿瘤、糖尿病等不同的疾病[3-4]。

红花多糖(saflower polysaccharide,SPS)是红花的主要药效成分之一,具有抗肿瘤、免疫调节、抗凝血、抑制炎症、改善脑损伤等多种药效作用[5-7]。本研究在前期工作基础上[8],通过盐酸林可霉素建立肠道菌群失调模型小鼠,探究红花多糖对肠道微生态恢复的影响,以期为红花多糖的进一步开发及临床应用提供更多数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性昆明小鼠50只,体质量(20±2)g,由吉林省实验动物中心提供,实验动物质量合格证编号:SCXK(吉)-2018-0007。

1.1.2 药物与试剂 红花多糖(批号CY180718),杨凌慈缘生物技术有限公司;丽珠肠乐双歧杆菌活菌胶囊(规格每粒0.35 g,批号20171115),丽珠集团丽珠制药厂;盐酸林可霉素注射液(规格2 mL:0.6 g,批号1802316),国药集团荣生制药有限公司;伊红美蓝琼脂(EMB)、肠球菌琼脂(EC)、双歧杆菌BS培养基、乳酸杆菌选择性培养基(LBS)、厌氧指示剂及厌氧袋,青岛海博生物技术有限公司;TNF-α、IL-6试剂盒,上海酶联生物科技有限公司。

1.1.3 实验仪器 BSC-1300ⅡA2生物安全柜,DW-86L386超低温冰箱(海尔),Multiskan Mk3酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备与分组、给药 50只SPF级昆明小鼠适应性饲养7 d 后,采用随机数字法随机选取40只小鼠,应用盐酸林可霉素灌胃(9 g/kg体质量),每天2次,连续灌胃3 d,构建肠道菌群失调模型小鼠。小鼠粪便变软、稀薄不成型,甚至水样便,说明造模成功。造模小鼠应用随机数字法随机分为模型组、红花多糖组、丽珠肠乐组、自然恢复组,另设正常鼠为对照组,每组10只。模型组于造模第4天采集标本进行检测,其余各组从第4天起灌胃给药[9]。红花多糖组灌胃150 mg/kg体质量的红花多糖,丽珠肠乐组灌胃7 mg/kg体质量的双歧杆菌活菌制剂,对照组、自然恢复组灌胃等体积的生理盐水,连续灌胃7 d。在整个实验过程中记录每天的进食量、测量小鼠体质量,据此调整灌胃量;并观察小鼠的毛发变化、粪便情况、尾部肛口干净程度、精神、活动等一般状况。

1.2.2 红花多糖对小鼠血清细胞因子的影响 模型组于第4天、其它各组于第11天摘眼球取血,置于1.5 mL离心管中,4 ℃离心10 min(4 000 r/min),取血清于-20 ℃保存待测。血清样品中TNF-α、IL-6 均采用ELISA 进行检测,严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理方法各组实验数据均采用SPSS 25.0软件进行统计学处理分析,结果用“平均值±标准差”表示,多组间比且方差齐性数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用LSD检验,P<0.05为差异具有统计学意义,P<0.01为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况正常对照组小鼠精神活泼、反应灵敏、被毛光亮、饮食正常、大小便正常;模型组小鼠在连续3 d灌胃盐酸林可霉素后,粪便变软、稀薄不成型、甚至水样便,精神不振、食量下降、被毛散乱、无光泽,说明建模成功、建模效果良好。给药治疗7 d后,红花多糖组和丽珠肠乐组小鼠饮水、饮食逐渐恢复良好,粪便逐渐成型,被毛及精神状态逐渐好转,日渐活跃。

2.2 肠道菌群计数单因素ANOVA检验结果显示,双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌各组菌计数差异均具有统计学意义:双歧杆菌(F=8.363,P=0.000),乳酸杆菌(F=156.202,P=0.000),肠杆菌(F=13.669,P=0.000),肠球菌(F=12.627,P=0.000)。在此之后进行两两比较,模型组小鼠经盐酸林可霉素灌胃3 d后,与对照组相比,肠道菌群数量发生明显改变,其中肠杆菌(P=0.000)、肠球菌数量明显增加(P=0.000),双歧杆菌(P=0.003)和乳酸杆菌(P=0.000)数量明显减少,表明通过灌胃盐酸林可霉素成功复制小鼠肠道菌群失调模型。自然恢复组与模型组相比,乳酸杆菌数量极显著提高(P=0.000),肠杆菌数量显著下降(P=0.000);肠球菌数量虽有下降,但与模型组相比,差异没有统计学意义(P=0.074);双歧杆菌自然恢复组与模型组相比差异也没有统计学意义(P=0.320);自然恢复组与对照组相比较,双歧杆菌(P=0.037)、肠球菌(P=0.000)差异有统计学意义,而乳酸杆菌(P=0.171)、肠杆菌(P=0.224) 差异没有统计学意义,说明小鼠自身具有一定的恢复能力,但无法恢复至正常水平。灌胃红花多糖和丽珠肠乐后,与自然恢复组相比,肠杆菌(红花多糖P=0.037,丽珠肠乐P=0.010)、肠球菌(红花多糖P=0.002,丽珠肠乐P=0.016)数量显著降低,乳酸杆菌(红花多糖P=0.001,丽珠肠乐P=0.000)、双歧杆菌(红花多糖P=0.001,丽珠肠乐P=0.001)数量显著提高。红花多糖对肠道菌群的影响与丽珠肠乐相比没有显著性差异。见表1。

表1 小鼠肠道菌群计数(lgCFU/g)

2.3 红花多糖对小鼠血清TNF-α、IL-6的影响单因素ANOVA检验结果显示,TNF-α(F=22.522,P=0.000)和IL-6(F=19.582,P=0.000)水平差异均具有统计学意义。在此之后进行两两比较,模型组与对照组相比TNF-α和IL-6水平极显著提高(P=0.000)。自然恢复组与模型组相比,TNF-α(P=0.097)和IL-6(P=0.111)水平虽有下降,但差异没有统计学意义。灌胃红花多糖和丽珠肠乐后,与自然恢复组相比,TNF-α和IL-6水平极显著降低(P=0.000,P=0.001)。上述结果表明,灌胃盐酸林可霉素使TNF-α和IL-6水平提高,给予红花多糖和丽珠肠乐,可使TNF-α和IL-6水平有所改善,说明二者均减轻了由盐酸林可霉素引起的炎症反应,对缓解炎症反应有着重要帮助,但红花多糖和丽珠肠乐二者之间没有显著性差异。见表2。

表2 小鼠血清中TNF-α、IL-6的含量

3 讨论

肠道菌群数量众多,正常情况下处于动态平衡状态,在维持机体健康中发挥重要作用;而菌群失调则伴随着机体生理功能的改变及多种疾病的发生,如炎症性肠病、类风湿性关节炎、肿瘤、糖尿病等[10-11]。肠道菌群中的双歧杆菌、乳酸杆菌等作为有益菌,可以产生细菌素及有机酸等阻止条件致病菌及致病菌的侵袭;肠杆菌、肠球菌等属于条件致病菌,在肠道菌群失衡时可导致感染的发生[12]。而抗生素的滥用,会破坏肠道菌群平衡,引起菌群紊乱。本研究首先利用盐酸林可霉素诱导肠道菌群失调模型小鼠,小鼠肠道四种菌群数量发生明显改变,双歧杆菌、乳酸杆菌数量显著下降,肠杆菌、肠球菌数量显著增高。提示抗生素盐酸林可霉素可引起明显的肠道菌群紊乱。然后,采用红花多糖给予肠道菌群失调小鼠灌胃7 d,可明显提高乳酸杆菌、双歧杆菌的数量,对肠杆菌、肠球菌有明显的抑制作用,说明红花多糖可以调整这四种肠道菌群,且与丽珠肠乐活菌制剂没有显著性差异。

肠道菌群失调往往伴随着炎症细胞因子的异常表达[13],而TNF-α和IL-6是重要的促炎细胞因子,因此,我们检测血清中TNF-α和IL-6的表达水平,与对照组相比,模型组TNF-α和IL-6水平极显著提高(P<0.01),表明抗生素诱导肠道菌群失调的同时也出现炎症反应。而给予红花多糖和丽珠肠乐活菌制剂治疗,可使TNF-α和IL-6水平明显下降,表明红花多糖和丽珠肠乐活菌制剂在一定程度上减轻了由盐酸林可霉素引起的炎症反应,对缓解炎症反应有着重要帮助,且二者之间没有显著性差异。

综上所述,双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌的变化,说明了红花多糖可改善小鼠由于盐酸林可霉素引起的肠道菌群失调状态;TNF-α和IL-6水平的变化,说明了红花多糖有很好的抗炎作用,这为后续进一步研究红花多糖调节肠道菌群的作用机制提供了实验基础。