霍楠楠,徐晓焱,张春杰,郑天翼,王瑞媛,李 齐,岳 辉,董泽嵩,刘洪凤,3

(1.牡丹江医学院;2.牡丹江市爱民区黄花社区卫生服务中心,黑龙江 牡丹江 157011;3.黑龙江中医药大学基础医学院,黑龙江 哈尔滨 150040)

酒精依赖是一种包括强迫性使用酒精和失去控制酒精摄入为特征,并伴随严重戒断综合征的一种精神障碍[1]。过量饮酒与高发病率和高死亡率相关,除去精神障碍之外,神经系统损伤、肝肾损害、胃肠道疾病、心血管疾病、糖尿病以及癌症的发生均与之有关,这对患者自身与其家庭和社会关系有着严重影响[2]。目前关于酒精依赖的研究大部分关注于其发病相关的分子机制,而关于酒精依赖形成过程中所伴随的脏器损害方面的研究相对较少。

在肾功能方面,酒精过度使用与肾小球肾炎、急性肾损伤、肾功能丧失和慢性肾脏疾病相关。酒精滥用的有害影响包括肾小球损害、高血压和高血压相关的肾硬化[3]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路在诸多肾脏系统疾病中发挥调节作用,如缺血缺氧肾损害、急慢性肾损伤、糖尿病肾病等[4]。

白藜芦醇是一种多酚类营养物质,对人体具有多种活性。白藜芦醇在肾脏疾病中的作用研究表明,它可以减少纤维化、系膜扩张、氧化应激和炎症细胞因子水平,同时改善肾脏结构和功能。白藜芦醇治疗可减少成纤维细胞增殖和激活,改善肾脏结构的维护[5]。因此本实验研究PTEN/PI3K/AKT通路在酒精依赖形成过程中在肾脏中的表达情况,以及白藜芦醇对该通路表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠30只,购自牡丹江医学院动物实验中心。于牡丹江医学院SPF级实验动物中心实验室进行动物模型的构建及检测。

1.1.2 主要试剂 无水乙醇(深圳迈瑞公司);RIPA、PMSF、ECL发光液(大连meilunbio公司);PVDF膜(0.45 μm,北京Biotopped公司);白藜芦醇(北京Solarbio公司);β-actin、PI3K、AKT、PTEN一抗(兔抗大鼠)、二抗(山羊抗兔,沈阳 万类生物公司);抗体稀释液(北京bioss公司)。

1.1.3 仪器 超微量核酸蛋白测定仪(NanoDrop 2000)(美国Thermo公司);电泳仪、转膜仪(美国BIO-RAD公司);Amersham Imager 600(美国GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 构建20%酒精依赖大鼠模型 SPF级雄性SD大鼠30只,单笼饲养,随机分为对照组(n=6)和20%饮酒组(n=24),进行适应性喂养一周后,开始实验。对照组为双瓶100 mL蒸馏水,饮酒组为一瓶100 mL蒸馏水和一瓶100 mL 20%酒精。对照组为双瓶蒸馏水,饮酒组大鼠第一天放置水瓶和酒精瓶,24 h后记录大鼠的饮酒量、饮水量(mL/24 h),同时将酒精瓶替换为水瓶,形成一个循环,每次更换水瓶和酒精瓶的位置、更新溶液,每周检测大鼠体重,连续建模4周,共28 d[6]。饮酒组大鼠的酒精摄入量[>3.15 g/(kg·24 h)]和酒精偏好(饮酒量占总液体摄入量的百分比)逐渐稳定时,即成功制备SD大鼠酒精依赖模型[7]。

1.2.2 灌胃给药 将建模成功的饮酒组大鼠随机分为4组,分别为酒精依赖模型组、白藜芦醇高、中、低剂量治疗组,每组各6只大鼠。给予酒精依赖白藜芦醇治疗组灌胃高[100 mg/(kg·24 h)]、中[50 mg/(kg·24 h)]和低[25 mg/(kg·24 h)]剂量白藜芦醇;对照组、酒精依赖模型组灌胃等体积生理盐水,连续灌胃14 d。

1.2.3 大鼠肾脏PI3K、AKT、PTEN蛋白表达水平检测 在大鼠麻醉处死后,摘取大鼠肾脏组织进行-80 ℃冻存备用。根据裂解液的使用说明裂解大鼠肾脏(RIPA 裂解液:PMSF=100∶1)并充分研磨,待研磨充分后冰上摇床30 min,4 ℃ 13 000转离心10 min,取上清蛋白,即获得大鼠肾脏组织全蛋白。分别提取2 μL总蛋白溶液,用仪器NanoDrop 2000对各组蛋白进行浓度测定,重复3次取平均值;按照公式5×VSDS-PAGE=VSDS-PAGE+V蛋白+V水;(V蛋白×C蛋白)÷(VSDS-PAGE+V蛋白+V水)=40/15,将蛋白定量至40 μg/15 μL,最后用锡纸密封离心管,将配好的蛋白煮沸10 min,-20 ℃保存。然后进行电泳(先80 V电压,待Marker分开后增压至120 V)、转膜(250 mA 90 min)、封闭(在封闭液中,摇床2～4 h)、漂洗(1×TBST漂洗1次,10 min)、孵育一抗(一抗浓度为1∶1 000,4 ℃摇床孵育12～14 h)、漂洗(1×TBST漂洗3次,每次10 min)、孵育二抗(二抗浓度为1∶20 000,室温摇床1 h)、漂洗(1×TBST漂洗3次,每次10 min)的过程,通过仪器Amersham Imager 600对目的蛋白条带灰度值和内参进行定量分析,以观察目的蛋白的相对表达情况。

1.3 统计学分析运用Graphpad prism 8.0进行统计学分析以及绘图,计量资料以“均数±标准差”来表示,两组间比较采用t检验,多组组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为具有统计学意义的标准进行分析。

2 结果

2.1 构建酒精依赖动物模型

2.1.1 模型构造期间大鼠体重变化 在酒精依赖模型构造期间,每7 d测量大鼠体重,以观察大鼠体重变化。对照组大鼠体重为与饮酒组大鼠体重无统计学差异(P>0.05),见表1。

表1 两组SD大鼠体重变化

2.1.2 20%酒精依赖模型组的酒精摄入量和酒精偏好 经28 d间断交替饮酒,饮酒组24只大鼠在最后7 d的酒精摄入量稳定在(11.11±1.13)g/(kg·24 h),统计分析表明,饮酒组在最后7 d的酒精摄入量无显著差异(F(3,92)=1.803,P>0.05);饮酒偏好稳定在(38.14±1.72)%,统计分析表明,饮酒组在最后7 d的饮酒偏好无显著差异(F(3,92)=0.441,P>0.05),模型制备成功可以进一步实验,见表2。

表2 饮酒组大鼠最后7 d的饮酒偏好和酒精摄入量

2.2 PTEN/PI3K/AKT信号通路在酒精依赖大鼠肾脏的表达情况酒精依赖模型组肾组织中PI3K和AKT的蛋白相对表达量较对照组显著升高(P<0.01),PTEN的相对表达量较对照组明显降低(P<0.05),白藜芦醇低剂量组肾组织中PI3K和AKT的蛋白相对表达量较对照组明显升高(P<0.05);与酒精依赖模型组比较,白藜芦醇高剂量治疗组大鼠肾组织中PI3K和AKT的表达显著降低(P<0.05),而白藜芦醇中剂量治疗组大鼠肾组织中PTEN的表达显著升高(P<0.05),见图1,表3。

图1 建模及给药后各组大鼠肾脏中PTEN、PI3K、AKT的蛋白相对表达量

表3 PTEN/PI3K/AKT在五组大鼠中的相对表达量

3 讨论

酒精消费是一个主要的公共健康问题[8],PI3K依赖信号通路调节细胞生长和存活,但新出现的证据表明PI3K通路在调节成瘾药物的行为反应中发挥作用[9]。内侧前额叶皮层内的神经适应与饮酒行为和戒断行为的分子机制有关,其中PI3K/AKT/GSK3β/CREB通路的激活是酒精戒断的重要分子机制[10]。

PI3K是细胞内的信号转导酶,它将 AKT招募到细胞膜上,随后它的激活调节许多细胞功能[11]。PI3K-AKT轴参与细胞生长、增殖、分化、运动、存活和细胞内贩运。PI3K磷酸化下游脂质成分磷脂酰肌醇-4-5-二磷酸(PIP2)肌醇环上的3羟基,产生第二信使,即PIP3,该分子激活AKT,在调节细胞增殖、存活和代谢等关键细胞过程中起着核心作用[12]。10号染色体上缺失的PTEN是抑癌基因[13],PTEN是一种,可以负调控PI3K信号通路,是一种通过去磷酸化PIP3调控PI3K的肿瘤抑制因子。PTEN的表达可以抑制肾脏纤维化的进展[14],可以通过调节肾小管细胞凋亡和信息在缺血性急性肾损伤的发病机制中发挥关键作用[15]。PTEN/PI3K/AKT信号通路在肾间质纤维化发生发展过程中,具有关键的调节作用[16]。肾间质纤维化与进行性肾功能丧失和终末期肾病密切相关[17]。然而肾脏内皮间充质转化和肾间质纤维化同样受PI3K/AKT信号通路的调节,该通路的表达会促进该病理进程的发展[18],目前的一些药理学研究发现,具有对PI3K/AKT信号通路强烈抑制作用的药物,在体内外实验中均表现出了对肾小球肾炎等疾病的积极治疗和预防作用[19]。PTEN的功能是可以下调PI3K/AKT信号通路。有研究表明,PTEN可调节肾脏形态、足细胞损伤和肾纤维化。

综上所述,由于酒精物质的特殊理化性质,我们开展了本次实验,以探究PTEN/PI3K/AKT信号通路在酒精依赖大鼠肾脏中的表达情况,我们发现在酒精依赖大鼠的肾脏中,PI3K、AKT的蛋白表达水平明显升高,PTEN的表达水平有所下调,这种变化对于炎性病变的产生具有促进作用,因此证明该通路确实参与到了酒精依赖形成过程的进展当中。并且,我们通过给与不同剂量的白藜芦醇,发现特定浓度的白藜芦醇对这些蛋白表达趋势有所逆转,这为白藜芦醇可以通过对该通路的调节作用发挥重要的生物学效应提供了一定的实验依据。