夏红霞，唐其柱，周 恒，刘哲宇

（1.武汉大学人民医院心血管内科，代谢与相关慢病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060；2.武汉大学第一临床学院，湖北 武汉 430060）

巨噬细胞是先天免疫系统的重要组成部分，在体内稳态和许多生理过程中发挥关键作用，如细胞代谢、清除衰老细胞和组织碎片、组织修复和重构等[1,2]。炎症存在于全身各系统疾病中，如在心血管系统中，心肌重构和心力衰竭与局部和全身炎症信号级联反应的激活有关[3,4]，巨噬细胞作为炎症反应中最主要的免疫防御细胞，可以释放促炎介质促进炎症因子的形成，从而促进疾病的进展。炎症反应中，大量的炎性单核细胞（巨噬细胞前体）通过趋化因子梯度和各种粘附分子从骨髓中被招募，并随着组织局部微环境释放的生长因子和细胞因子而发生表型和功能的显著改变。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信 号通路介导了炎症反应中促炎细胞因子和趋化因子的产生，参与抗炎和组织损伤的预防过程[5,6]。MAPK 相互作用丝苏氨酸激酶1（MAPK-interacting serine/threonine kinase 1，Mnk1）是Mnks 激 酶（Mnk1 和Mnk2）之一，在所有成年组织均有较多表达[7,8]。Spry2 是Mnks 重 要 的 底 物 之 一[9]。Spry 蛋 白属于一组抑制ERK 激活和信号传导的膜相关蛋白[7]。研 究 表 明，Mnk1 可 磷 酸 化Spry2 的S112 和S121 两个位点，从而延长Spry2 的半衰期，增强Spry2 的 稳 定 性，抑 制ERK 信 号 转 导[7]。MAPKs 信号通路在炎症中的作用及相关机制已有大量研究，而Mnk1 对炎症的影响及其对巨噬细胞的功能调节的研究鲜有报道，本研究推测Mnk1可能通过调节其底物Spry2 的表达，从而影响巨噬细胞在炎症反应中的功能变化。因此，本研究通过体内外实验初步探讨Mnk1基因缺失对LPS 诱导的巨噬细胞炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

脂多糖购于美国Sigma 公司，RPMI 1640 培养基和胎牛血清购于美国Gibco 公司，红细胞裂解液购于碧云天生物，RIPA 裂解液（美国赛默飞世尔公司，89900），抗F4/80、Spry2 抗体购于英国Abcam公司，GAPDH、Mnk1、ERK1/2、P-ERK1/2、P-p38、P-JNK 抗体购于美国CST 公司。Trizol 试剂购于美国赛默飞世尔公司，反转录试剂盒和PCR 试剂购于瑞 士Roche 公 司，IL-1β Elisa 试 剂 盒 购 于 上 海 酶 联生物。定量RT-PCR 仪为瑞士Roche 公司生产（型号：LC480）。

1.2 实验动物

选取8～10 周龄健康雄性WT、Mnk1 基因KO小鼠，体质量23.5～27.5 g。WT 小鼠购自中国医学科学院医学实验动物研究所，Mnk1 KO 小鼠是由日本大阪大学前沿生物科学研究生院Rikiro Fukunaga 教授友情赠予，均饲养于武汉大学人民医院心血管病研究所，饲养环境SPF 级。所有操作经武汉大学人民医院动物福利伦理审查委员会批准（批号：20171202）。

1.3 分离小鼠脾脏巨噬细胞

腹腔注射PBS 或LPS（1 mg/mL）的小鼠眼眶取血后分离血清，Elisa 试剂盒检测血清中IL-1β 的浓度；分离上述小鼠脾脏巨噬细胞：颈椎脱臼法处死小鼠后取出脾脏，剪成小块置于含有冷的RPMI 1640 小皿中并机械研磨脾脏组织块，用200 目无菌筛网过滤得混悬液，将此混悬液1 000 r/min 离心3 min 除去细胞碎片，加入红细胞裂解液裂解红细胞，5 min 后1 000 r/min 离心3 min 除去红细胞碎片，PBS 洗涤3 次后用RPMI 1640 重悬得到脾脏巨噬细胞，将此悬液接种于细胞培养板中于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，24 h 后弃去上清，用RPMI 1640 培养基洗1～2 次，弃去未黏附细胞，贴壁细胞为单层巨噬细胞。

1.4 小鼠腹腔Mφ 提取及分组处理

参照继往文献报道的方法［10］，颈椎脱臼法处死小鼠后，无菌条件下PBS 灌洗并收集腹腔液。1 000 rpm 离心10 min，所得细胞沉淀用 RPMI 1640培养基重悬接种至6 孔板中，于37 ℃培养4 h 后，洗去未贴壁细胞，余下的贴壁细胞即为腹腔Mφ，并在显微镜下观察细胞形态。体外使用 LPS（终浓度10 ng/mL）刺激腹腔Mφ，分为WT+PBS 组、KO+PBS 组、WT +LPS 组、KO+LPS 组，每 组6 只小鼠。

1.5 巨噬细胞黏附功能检测

腹腔注射PBS 或LPS（1 mg/mL）的各组小鼠提取出巨噬细胞后，调整巨噬细胞数至2.0×106/ mL，每管500 μL 加入1.5 mLEP 管内，EP 管置于37℃水浴摇床分别震荡培养10、30 min 和60 min，各时间点分别取100 μL 细胞悬液，用细胞计数仪检测细胞密度。黏附功能以黏附率=（初始细胞密度-某时间点悬液中细胞密度）/初始细胞密度×100%表示。

1.6 细胞腺病毒转染

将上述1.4 培养的Mφ 铺于6 孔板，按照MOI=100 加入过表达Spry2 的腺病毒［11］（中国山东维真生物构建），分为WT+AdGFP、KO+ AdGFP 、KO+AdSpry2 组，37℃培养箱培养4 h 后换无血清的培养基，12 h 后每组均用LPS（10 ng/mL）刺激24 h。

1.7 巨噬细胞免疫荧光染色观察细胞形态

使用抗F4/80 抗体对提取的WT 和Mnk1 小鼠腹腔Mφ 进行免疫荧光染色，用含DAPI 的抗荧光淬灭剂封片，然后于正置荧光显微镜下观察，拍照。

1.8 Western blot 法检测相应蛋白表达变化

取各组Mφ，加入RIPA 裂解液进行裂解，提取蛋白并定量。 每孔蛋白上样量50 μg 进行SDS-PAGE 电泳。转膜、封闭后分别孵育一抗GAPDH、Mnk1、Spry2、ERK1/2、P-ERK1/2、P-p38、P-JNK 抗 体 4 °C 过 夜，次 日 二 抗 孵 育1 h 后显色。以GAPDH 作为内参，采用Image lab 软件检测各条带的吸光度（OD）值。

1.9 RT-qPCR

采用Trizol 法提取各组脾脏Mφ 和腹腔Mφ 总RNA 后，反转录为cDNA，再用RT-qPCR 试剂盒扩增 上 述cDNA 并 分 析LFA-1α、CD206、IL-1β 和Spry2 的mRNA 表达情况。引物均由上海生工生物公司合成，主要基因引物序列：LFA-1α（上游引物：5'-CATGCAGCCTATCCTGAGAC-3'， 下 游 引物 ： 5'-AATCGCACCCAGTAGGCATC-3'） ；CD206 （ 上 游 引 物 ：5'-AAACACAGACTGACCCTTCCC-3'，下 游 引 物：5'-GTTAGTGTACCGCACCCTCC-3'）IL-1β（ 上 游 引 物 ：5'-GGCAACTGTTCCTGAACTCAA-3'，下 游 引物：5'-GACAGCCCAGGTCAAAGGTT-3'）；iNOS（上游引物：5'-TCGGGTTGAAGTGGTATGC-3'，下游引物： 5'- TCGGGTTGAAGTGGTATGC-3'）；Arg1（上 游 引 物：5'-AGTGTGGTGCTGGGTGGAGAC-3'，下 游 引 物： 5'-GCGGAGTGTTGATGTCAGTGTGAG-3'）Spry2（上游引物：5'-TGAAAGACTCCACGGTCTGC-3'，下游引物：5'-AGCTGACAGTGCTGATGGAC-3'）。

1.10 统计学分析

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，结果用均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用独立样本t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠腹腔巨噬细胞染色及Mnk1 的表达

实验提取WT 和KO 小鼠腹腔Mφ，免疫荧光染色结果如图1A 所示，可观察到两组细胞中表达F4/80+的细胞。Western blot 检测WT、KO 巨噬细胞Mnk1 的表达如图1B 所示。

图1 小鼠腹腔巨噬细胞免疫荧光染色及Mnk1 表达Fig 1 Immunofluorescence staining and Mnk1 expression of mouse peritoneal macrophages

2.2 Mnk1 基因敲除影响LPS 诱导的巨噬细胞极化和黏附

在LPS 刺激下，WT、KO 组Mφ IL-1β、iNOS 的mRNA 表达水平较PBS 组明显升高，CD206、Arg1表达水平较PBS 组明显下降（P＜0.05，表1）。与WT+LPS 组 比，KO+LPS 组Mφ IL-1β、iNOS 的mRNA 表达水平升高更显著，而CD206、Arg1 表达水平下降更明显（P＜0.05，表1）。在体实验提示，小鼠腹腔注射LPS 后，KO 组比WT 组小鼠血清中IL-1β 的浓度升高也更为显著，且KO 组比WT 组脾脏Mφ 中IL-1β 的mRNA 表 达 也 显 著 升 高（P＜0.05，表3）。故Mnk1 可能进一步影响了LPS 刺激下Mφ 的极化。另 一方面，与WT 组相比，KO 组LFA-1α 的mRNA 表达水平下降（P＜0.05）；经过LPS 的刺激后，KO+LPS 组Mφ LFA-1α 的mRNA表达水平明显上升（P＜0.05，表1）。然而，WT 组Mφ 在LPS 刺激前、后的LFA -1α 的mRNA 表达无显著差异（P＞0.05，表1）。在巨噬细胞黏附功能实验中，各时间点的LPS 组Mφ 的黏附率均较PBS 组显著增高（P＜0.05，表2）；与WT+PBS 组相比，KO+LPS 组Mφ 的黏附率有明显升高，且在30 min、60 min 时，KO+PBS 组较WT+PBS 组的Mφ黏附率也有升高（P＜0.05，表2）。因此，Mnk1 可能影响了LPS 刺激条件下Mφ 的黏附作用。

表2 各组巨噬细胞的LFA-1α 和Spry2 的mRNA 表达水平以及巨噬细胞黏附功能（n=6，±s）Tab 2 LFA-1 of macrophages in each group α MRNA expression level and macrophage adhesion function of Spry2 and Spry2（n=6，±s）

表2 各组巨噬细胞的LFA-1α 和Spry2 的mRNA 表达水平以及巨噬细胞黏附功能（n=6，±s）Tab 2 LFA-1 of macrophages in each group α MRNA expression level and macrophage adhesion function of Spry2 and Spry2（n=6，±s）

与WT+PBS 组相比， aP＜0.05；与KO+PBS 相比，bP＜0.05；与对照组（WT+PBS 组、KO+PBS 组）相比，cP＜0.05；与WT+LPS 组比， dP＜0.05； 与WT+PBS 组相比， eP＜0.05

组别WT+PBS KO+PBS WT+LPS KO+LPS黏附率mRNA 表达Spry2 0.0077±0.0009 0.0042±0.0021a 0.0047±0.0007 0.0008±0.0001b 34.407＜0.0001 10 min 15.75±3.29 13.06±1.86 24.36±5.88c 40.27±4.68c,d 25.515＜0.0001 30 min 36.24±3.48 53.26±1.26e 62.82±0.92c 74.20±1.77c,d 175.267＜0.0001 60 min 38.34±9.00 64.96±1.39e 69.50±3.04c 80.15±4.80c,d 32.910＜0.0001 FP LFA-1α 0.0590±0.0175 0.0290±0.0025a 0.0513±0.0044 0.0955±0.0271b 17.163＜0.0001

2.3 LPS 诱导的Mnk1 KO 巨噬细胞中Spry2 mRNA 的表达变化

与WT 组 相 比，KO 组Spry2 的mRNA 表 达 水平显著下降（P＜0.05，表1），且KO+LPS 组Spry2的mRNA 表达水平较KO+PBS 组下降更显著，具有统计学差异（P＜0.05，表1）。体内实验中脾脏Mφ Spry2 的mRNA 表达也符合上述变化（表3）。

表1 各组巨噬细胞的IL-1β、iNOS、CD206、Arg1 的mRNA 表达水平（n=6，±s）Tab 1 IL-1 of macrophages in each group β、 MRNA expression levels of iNOS， CD206， Arg1（n=6，±s）

表1 各组巨噬细胞的IL-1β、iNOS、CD206、Arg1 的mRNA 表达水平（n=6，±s）Tab 1 IL-1 of macrophages in each group β、 MRNA expression levels of iNOS， CD206， Arg1（n=6，±s）

注：与对照组（WT+PBS 组、KO+PBS 组）相比，a P ＜0.05；与WT+LPS 组比， b P ＜0.05。

Arg1 2.1653±0.2888 2.0497±0.0675 1.3897±0.0307a 0.6591±0.0275a,b 129.109＜0.000 1组别WT+PBS KO+PBS WT+LPS KO+LPS FP IL-1β 0.0696±0.0109 0.0410±0.0111 0.5734±0.0291a 0.8336±0.0756a,b 533.957＜0.000 1 iNOS 0.0001±0.0000 0.0001±0.0000 0.0060±0.0006a 0.0108±0.0028a,b 78.848＜0.000 1 CD206 0.0766±0.0249 0.0603±0.0038 0.0080±0.0022a 0.0030±0.0005a,b 51.285＜0.000 1

表3 体内实验血清IL-1β 浓度和脾脏巨噬细胞IL-1β、Spry2 的mRNA 表达水平（n=6，±s）Tab 3 Serum concentration of IL-1β in vivo and mRNA expression level of splenic macrophages IL-1β and Spry2（n=6，±s）

表3 体内实验血清IL-1β 浓度和脾脏巨噬细胞IL-1β、Spry2 的mRNA 表达水平（n=6，±s）Tab 3 Serum concentration of IL-1β in vivo and mRNA expression level of splenic macrophages IL-1β and Spry2（n=6，±s）

注：与对照组（WT+PBS 组、KO+PBS 组）相比，aP＜0.05；与WT+LPS 组比， bP＜0.05；与WT+PBS 组相比， cP＜0.05；与KO+PBS相比，dP＜0.05

Spry2组别 血清IL-1β（pg/mL）IL-1β 1.297 7±0.068 7 0.624 0±0.033 4c 0.914 9±0.571 5 0.225 8±0.404 4d 409.139＜0.000 1 WT+PBS KO+PBS WT+LPS KO+LPS FP 27.00±1.33 18.15±1.37 74.56±3.21 a 117.24±1.09 a,b 3 343.582＜0.000 1 0.523 1±0.067 8 0.326 7±0.043 6 1.256 9±0.085 1 a 2.495 5±0.129 8 a,b 756.506＜0.000 1

2.4 Mnk1 基因敲除影响LPS 诱导的巨噬细胞功能变化的机制

Western blot 结 果 显 示（图2A），四 组Mφ 总ERK1/2 的 表 达 无 差 异，LPS 刺 激 后，WT 组P-ERK1/2 表 达 较PBS 组 升 高，KO 组 的P-ERK1/2表达较对应的PBS 组也明显升高。与WT+LPS 组相比，KO+LPS 组P-ERK1/2 表达水平明显升高，而Spry2的表达水平明显下降。且实验结果显示WT+LPS 组和KO+LPS 组 的P-p38、P-JNK 表达无明显差异（文中未展出数据）。表明Mnk1可能主要影响Spry2/ERK1/2通路调节巨噬细胞炎症水平。为进一步验证上述结果，使用Spry2 过表达腺病毒和对照病毒 转 染Mφ，验 证WT+AdGFP、KO+AdGFP、KO+AdSpry2 三 组Mφ 中Spry2 和P-ERK1/2 蛋 白表 达变化。如图2B 所示：KO+AdSpry2 组Spry2 的表达明显上调，表明腺病毒转染成功。同时KO+Ad-Spry2组较KO+AdGFP组P-ERK1/2蛋白表达显著下降。提示LPS 刺激的Mφ 中，Mnk1 参与了Spry2/ERK1/2 信号通路的调控。Mnk1很可能通过Spry2/ERK1/2信号通路影响巨噬细胞功能。

图2 各组巨噬细胞相关蛋白表达水平Fig 2 Expression level of macrophage associated protein in each group

3 讨论

本研究发现，Mnk1 可以影响LPS 刺激后的巨噬细胞炎症水平，在体实验显示，KO 组小鼠腹腔注射LPS 后其血清炎症因子IL-1β 和脾脏Mφ 的IL-1β表达水平均较WT 组明显升高。Mnk1 KO 的Mφ在LPS 刺激后，其炎症因子IL-1β、iNOS 和黏附因子LFA-1α 的表达较对照组和WT+LPS 组均有升高，M2 型Mφ 表面标志物CD206、Arg1 的表达较对照组和WT+LPS 组明显下降，且KO 组Mφ 黏附率较WT 组显著升高。进一步研究发现，Mnk1 调节Mφ 炎症可能是通过Spry2/ERK1/2 通路实现的，在验证蛋白水平表达时发现，较WT 组比较，LPS 刺激使Mnk1 KO 组的Mφ Spry2 表达下降，P-ERK1/2表达升高。Mφ 转染过表达Spry2 的腺病毒并用LPS 刺激后，KO+AdSpry2 组Mφ Spry2 表达上升，P-ERK1/2 表达较KO+AdGFP 组明显下降。

研究显示，Mφ 分M1 和M2 两种表型，LPS 可刺激Mφ 转化为M1 型，使M1 表型标志物IL-1β、iNOS、TNF-α、IL-6 等表达升高，并使M2 表型标志物CD206、Arg1 表达降低［12-15］。LPS 刺激的小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 的水平显著升高［16］，LPS 刺 激的Mφ 中的LFA-1 表达显著增加［17］，且LPS 刺激可使Mφ 黏附能力增强［18］。提示LPS 刺激可增强Mφ 促炎表型，减弱了Mφ 向M2 型极化及其抗炎作用，Mφ 黏附作用也相应增强。本研究中，LPS 刺激使Mnk1 KO 组 小 鼠 血 清IL-1β 和 脾 脏Mφ 的IL-1β 表达均较WT 组明显升高；LPS 刺激后，Mnk1 KO 组Mφ 的 IL-1β、iNOS 和LFA-1α 的表达较对照组和WT+LPS 组 均 明 显 升 高，M2 型Mφ 表 面 标 志 物CD206、Arg1 的表达较对照组和WT+LPS 组明显下降。因此，Mnk1 KO 后，在LPS 刺激下，Mφ 向M1 型极化增加，向M2 型极化减少，Mφ 黏附率及黏附相关因子表达上调，故Mnk1 在LPS 刺激条件下，可以调节巨噬细胞的极化和黏附。

有研究指出，Spry2 通过与GRB2 结合，抑制Ras/ERK 信 号 通 路［19，20］。更 有 研 究 显 示，Mnk1 缺失会导致显著的心肌肥大、纤维化、功能障碍和心肌细胞凋亡，Mnk1 的抗心肌肥厚作用可能是通过调节Spry2 的表达，抑制ERK1/2 的激活而实现的［11］。提示Mnk1 与Spry2/ERK1/2 信号通路密切相关。本研究中，LPS 刺激后，Mnk1 KO 小鼠脾脏Mφ 的Spry2 mRNA 表达水平较PBS 刺激的对照组显著下调；且Mnk1 KO 小鼠腹腔Mφ 中Spry2 mRNA 和Spry2 蛋白表达水平较PBS 组明显下降；进一步研究显示，LPS 刺激后，Mnk1 KO 小鼠腹腔Mφ 中P-ERK1/2 表达水平较WT 组明显升高；使用过表达Spry2 腺病毒恢复LPS 刺激后Mnk1 KO 小鼠腹腔Mφ 中Spry2 表达，抑制P-ERK1/2 的表达。因 此，LPS 刺 激 的Mφ 中，Mnk1 参 与 了Spry2/ERK1/2 信号通路的调控。

综上所述，本研究发现Mnk1 基因敲除可增强LPS 诱导的Mφ 炎症反应，其机制可能是通过调节Spry2/ERK1/2 通路发挥作用。本研究提示Mnk1有可能成为调节炎症性疾病的靶点，为治疗巨噬细胞参与的相关炎症疾病提供实验依据。

作者贡献度说明：

夏红霞：负责参与实验、查阅文献及论文撰写；唐其柱：负责课题设计指导、试剂和相关耗材购买、文章写作指导；周恒：论文撰写和校对；刘哲宇：负责数据分析并参与实验。

所有作者声明不存在利益冲突关系。