朱彩玉，朱 磊，顾一帆，韩士鼎，徐 寰，侯文渊，周正新

（1.安徽中医药大学第一临床医学院，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031）

糖皮质激素（glucocorticoids， GCs）是临床常用的抗炎和自身免疫调节剂，长期或大剂量使用会导致 激 素 性 股 骨 头 坏 死［1］（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）。SANFH 的发生机制尚不明确，目前的研究表明，GCs 环境下细胞自噬程序的过度激活，会导致成骨细胞大面积凋亡，造成骨量减少、股骨头塌陷［2-5］。因此调控成骨细胞自噬与凋亡，促进股骨头坏死区骨修复与重建，可能是SANFH 的治疗靶点。

近年来，中医药因治疗股骨头坏死的独特优势而逐渐成为时下研究的热点［6，7］。以往一些关于中药治疗该病的机制研究中［8-10］，大多侧重于血管内高凝状态、间充质干细胞分化异常及骨质疏松等，而中药调控成骨细胞自噬及凋亡的研究相对较少。中药骨痹通消颗粒，立足于中医补肾活血、通络开痹等理论，选择从整体上调节机体内环境，从而达到补肾壮骨、活血通络的功效，是课题组长期使用的保髋经验基础方，配合手术能显著改善保髋预后，临床疗效确切［11，12］。前期实验发现［13］，骨痹通消颗粒能够有效减少SNAFH 家兔模型股骨头区成骨细胞凋亡，降低空骨陷窝率。为进一步证实骨痹通消颗粒的保护作用，本实验通过体外诱导小鼠MC3T3-E1 细胞模型，在细胞分子水平观察骨痹通颗粒消含药血清对 GCs 致成骨细胞功能损伤的影响，并从细胞自噬与凋亡角度出发探索其作用机制，进而为中药骨痹通消颗粒防治SANFH 提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞 选用10 只健康成年雄性清洁级新西兰白兔制备骨痹通消颗粒含药血清，体质量3.5～4.0 kg。购自安徽省实验动物中心（许可证号：SYXK（皖）2020-001，动物合格证号：NO.202213666），饲养于安徽中医药大学实验动物中心。动物实验由安徽中医药大学动物实验伦理委员会批准（伦理编号：AHUCM-rabbits-2022020）。小鼠成骨前体细胞MC3TE-E1 由赛百慷（上海）生物技术股份有限公司提供（批号：iCell-m031）。

1.1.2 实验药物 丹参15 g，川芎10 g，赤芍12 g，当归10 g，制淫羊藿10 g，土鳖虫6 g，肉桂4 g，甘草6 g，续断片10 g，由安徽中医药大学第一附属医院制成骨痹通消颗粒。注射用地塞米松磷酸钠购自安徽中医药大学第一附属医院药房（丰原制药，批号：201011-1）。

1.1.3 实验试剂及仪器 胎牛血清（新西兰NEWZERUM 公司，批号：FBS-S010321）；DMEM 基础培养基、胰酶（美国Gibco 公司，批号：8121506、2186968）；CCK-8 检测试剂盒（Biosharp 生物，批号：21172249）；细胞自噬/凋亡检测试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒（ 上海碧云天生物，批号：082521210907、062521210726）；SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒（索莱宝生物公司，批号：CR2110087）；总RNA 快速提取试剂盒（广州美基生物，批号：RJH19-01）；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒（上海新贝生物，批号：F2987、F3528）；β-actin、Beclin-1、Bax 及Bcl-2 鼠 抗 均 购 自Bioss 公 司（批 号：AH11286487、BA09245415、BJ10163878、BJ11026965）；羊抗鼠IgG二抗（博士德生物，批号：BST16D22C16C54）；CO2胞 培 养 箱（ 美 国 NuAire 公 司，型 号：NU-5820E）；细胞超净台（苏州苏净安泰公司，型号：SW-CJ）；激光扫描共聚焦显微镜（日本OLYMPUS 公司，型号：CX53）；Count star 细胞计数仪（上海睿钰生物，型号：IC1000）；全波段酶标仪（美国BioTek 公司，型号：Epoch 2）；梯度PCR 仪（美国ABI 公司，型号：ABI Veriti）；荧光定量PCR 仪（瑞士Roche 公司，型号：LightCycler480Ⅱ）；蛋白凝胶成像仪（上海天能公司，型号：VE-180）。

1.2 实验方法

1.2.1 骨痹通消颗粒含药血清制备 新西兰白兔适应性饲养2 周后，按人与动物体质量折算的等效剂量换算给药量［家兔等效剂量=（人药物剂量）/60 kg × 3.3］，给予4.5 g/kg 的骨痹通消颗粒进行灌喂，每天灌喂2 次，连续7 d。末次灌胃2 h 后，用3%戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉，腹主动脉采血，无菌分离血清，56℃水浴灭活30 min，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。采血结束后，对实验动物进行耳缘静脉空气注射处死，动物尸体送至安徽中医药大学实验动物中心统一处理。

1.2.2 分组与干预 设置空白对照组、实验组、模型组。无激素诱导细胞作为空白对照组（基础培养基+体积分数为10%的空白血清）。参考文献中方法［14］，使用梯度浓度地塞米松（dexamethasone，Dex）（10-5M、10-6M、10-7M）溶液诱导细胞损伤，随后将体外激素诱导的MC3T3-E1 细胞分为模型组（基础培养基+体积分数为10%的空白血清）、实验组（基础培养基+体积分数为10%的骨痹通消含药血清）。

1.3 主要观察指标

1.3.1 细胞活力检测 收集重悬MC3T3-E1 细胞，按照2×103个/孔接种至96 孔板中，每组10 个复孔。待细胞贴壁后，更换为含有不同血清的培养基继续培 养。24、48 及72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，放回培养箱中孵育1 h，随后将96 孔板放入酶标仪中，在450 nm 处测定吸光度（OD 值）。

1.3.2 MDC/PI 染色法检测 MC3T3-E1 细胞自噬及凋亡情况 重悬对数生长期的细胞，按照1×105个/孔接种于六孔板中，待细胞贴壁后，更换成不同培养基继续培养。培养一定时间后移除培养基，用PBS 缓 冲 液 洗 涤1 次，每 孔 加 入1 mL MDC/PI 染 色液，在细胞培养箱中37 ℃避光孵育30 min。后吸净MDC/PI 染色液，使用Assay Buffer 洗涤3 次，最后再加入1 mL Assay Buffer 于倒置荧光显微镜下观察细胞自噬及凋亡情况。

1.3.3 Western-blot 检测各组目标蛋白的表达水平 使用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白含量后进行SDS-PAGE 凝胶电泳，每孔上样10 μL，marker 5 μL，半湿法电转至聚偏二氟乙烯薄膜（PVDF 膜）上，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别孵育1∶1 000 浓度稀释的Beclin-1、Bax、Bcl-2、β-actin（内参）一抗，4 ℃配摇床过夜。TBST 洗膜3 次，用马来酰胺过氧化物酶偶联的二抗（1∶5 000）室温配摇床孵育2 h，再次洗膜后使用增强化学发光蛋白质印迹系统检测图像，采用Image J 软件对条带进行分析，以目标蛋白与内参蛋白灰度值之比计算蛋白相对表达量。

1.3.4 RT-qPCR 检测各组目的基因的表达 各组MC3T3-E1 细胞培养72 h 后，使用双柱离心法快速提取细胞总RNA，并使用紫外分光光度计测其纯度。根据目的基因在GeneBank 中的己知序列，采用Primer 5.0 设计引物（表1）。根据逆转录及实时荧光定量PCR 试剂盒说明，设置反应程序，放入q-PCR 仪中进行逆转录、扩增并定量检测。以β-actin 为内参，结果采用 2-ΔΔCt法进行统计分析。

表1 各基因引物序列Tab 1 Primer sequences of each gene

1.4 统计学处理

实验数据采用SPSS 25.0 统计软件进行分析处理。实验重复3 次，数值变量资料使用均数±标准差（±s）进行描述，两组间样本均数比较采用t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两组间进一步比较采用Dunnett-t 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 糖皮质激素对成骨细胞活力的影响

根据CCK-8 实验结果可知，与对照组相比，模型组MC3T3-E1 细胞在GCs 环境中数量减少且呈时 间 和 剂 量 依 赖 性（F=78.732，P＜0.01；F=39.698，P＜0.01）。 不 同 剂 量 Dex 诱 导 的MC3T3-E1 细胞在24 h 后与正常未处理的细胞相比没有明显差异（P＞0.05），48 h 后仅10-5M 组细胞活力与对照组相比存在差异（P＜0.01），而在Dex 诱导72 h 后，各组的细胞活力显著降低（P＜0.01）。（图1，表2）。

表2 细胞活力情况（n=10，±s）Tab 2 Cell viability （n=10，±s）

表2 细胞活力情况（n=10，±s）Tab 2 Cell viability （n=10，±s）

注：与对照组相比，**P＜0.01。

分组时间48 h 0.968±0.060 0.900±0.062 0.876±0.057 0.827±0.065**4.591 0.017 72 h 0.974±0.077 0.841±0.055**0.751±0.030**0.590±0.028**49.188＜0.01 Control MC3T3-E1 10-7M Dex 10-6M Dex 10-5M Dex FP 24 h 1±0.035 0.981±0.104 0.949±0.081 0.909±0.032 5.141 0.162

图1 Dex 随时间对MC3T3-E1 细胞活力的影响Fig 1 Influence of of Dex on MC3T3-E1 cell viability over time

2.2 糖皮质激素对成骨细胞自噬及凋亡的影响

Western-blot 分析结果如图所示，暴露72 h 后，自噬标记物Beclin-1 的表达水平从最低剂量（10-7M）开始增加，最大反应出现在10-6M Dex 组。当用10-5M Dex 处理MC3T3-E1 细胞时，与10-6M Dex组相比，Beclin-1 的表达显著降低，几乎恢复到正常水平。然而，与空白对照组相比，10-5M Dex 组的促凋亡蛋白Bax 显著增加（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2 表达水平下降（P＜0.01）。见图2 及表3。

图2 糖皮质激素诱导成骨细胞自噬及凋亡情况Fig 2 Osteoblast autophagy and apoptosis induced by glucocorticoid

表3 蛋白免疫印迹分析半定量结果（n=3，±s）Tab 3 Western blot analysis of semi-quantitative results of protein（n=3，±s）

表3 蛋白免疫印迹分析半定量结果（n=3，±s）Tab 3 Western blot analysis of semi-quantitative results of protein（n=3，±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；Dex 诱导72 h 后，A～C 目标蛋白的免疫印迹分析，D～F 用内参蛋白校正后的蛋白相对表达量。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；##P＜0.01。

分组蛋白Bax 0.461±0.084 0.608±0.049 0.950±0.056**1.372±0.109**80.526＜0.01 Bcl-2 1.023±0.092 0.826±0.068*0.701±0.033**0.142±0.031**113.206＜0.01 Control MC3T3-E1 10-7M Dex 10-6M Dex 10-5M Dex F P Beclin-1 0.253±0.030 0.671±0.046**1.062±0.102**0.430±0.058*87.572＜0.01

2.3 骨痹通消颗粒含药血清对各组细胞自噬的影响

与对照组相比，模型组暴露72 h 后，10-7M 与10-6M Dex 组细胞自噬率明显提高，10-5M Dex 组细胞自噬水平反而下降（P＜0.01）。而在与骨痹通消颗粒含药血清联合处理后，与模型组相比，实验组各组细胞自噬水平均得到抑制，并且呈剂量相关性（P＜0.01)。见表4。

表4 各组小鼠MC3T3-E1 细胞自噬率比较（n=3，±s）Tab 4 Comparison of autophagy rate of MC3T3-E1 cells in each group（n=3，±s）

表4 各组小鼠MC3T3-E1 细胞自噬率比较（n=3，±s）Tab 4 Comparison of autophagy rate of MC3T3-E1 cells in each group（n=3，±s）

注：与对照组相比，*P＜0.01，**P＜0.01；与模型组相比，##P＜0.01

组别对照组模型组F P剂量-10-7M Dex 10-6M Dex 10-5M Dex 10-7M Dex+GBTX 10-6M Dex+GBTX 10-5M Dex+GBTX自噬率（%）5.925±0.185 26.538±3.338**38.726±5.779**16.631±2.665**10.305±1.163##13.652±3.245##14.116±2.227＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01 0.341 37.969实验组-- - - - -

2.4 骨痹通消颗粒含药血清对各组细胞凋亡的影响

镜下观察结果显示，对照组细胞凋亡染色仅见个别红色荧光点，模型组经不同浓Dex 诱导损伤后，可见大片或散在明显的凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞。与模型组相比，骨痹通消颗粒含药血清干预72 h 后，各组红色荧光明显减少（P＜0.01）。细胞凋镜下观察结果显示，对照组细胞凋亡染色仅见个别红色荧光点，模型组经不同浓Dex 诱导损伤后，可见大片或散在明显的凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞。与模型组相比，骨痹通消颗粒含药血清干预72 h 后，各组红色荧光明显减少（P＜0.01）。细胞凋亡染色红色荧光半定量结果也显示骨痹通消颗粒含药血清对GCs 致成骨细胞凋亡具有明显的保护作用。见表5 及图3、4。

表5 细胞凋亡染色半定量结果比较（n=3，±s）Tab 5 Comparison of semi-quantitative results of apoptosis staining（n=3，±s）

表5 细胞凋亡染色半定量结果比较（n=3，±s）Tab 5 Comparison of semi-quantitative results of apoptosis staining（n=3，±s）

注：与对照组相比，**P＜0.01；与模型组相比，##P＜0.01。

分组剂量10-7M Dex 10-6M Dex 10-5M Dex Control MC3T3-E1 2.753±0.250 3.050±0.200 4.053±1.050 Dex 9.633±0.375**20.990±1.414**33.310±2.213**Dex+GBTX 4.817±0.252##5.417±1.218##8.513±1.357##F P 420.653 242.753 285.048＜0.01＜0.01＜0.01

图3 Dex 加或不加骨痹通消颗粒含药血清培养72 h 后细胞凋亡水平 （PI 染色×40）Fig 3 Apoptosis levels of cells after 72 h culture with or without Dex plus Gubi Tongxiao granules containing serum （PI staining ×40）

图4 细胞凋亡染色半定量分析Fig 4 Semi-quantitative analysis of apoptosis staining

2.5 骨痹通消颗粒含药血清对各组细胞Beclin-1、Bcl-2 及 Bax mRNA 表 达 的 影 响

为进一步证明骨痹通消颗粒对GCs 致成骨细胞损伤的保护作用，各组细胞在培养72 h 后检测mRNA 表达水平的变化。与对照组相比，模型组细胞Beclin-1 及Bax mRNA 表达明显升高，Bcl-2 mRNA 水平下降（P＜0.01）。实验组经骨痹通消颗粒含药血清干预后Bcl-2 mRNA 表达上调，Beclin-1及Bax mRNA 的表达则受到抑制（P＜0.01）。见图5 及表6。

图5 骨痹通消颗粒含药血清对MC3T3-E1 mRNA 的影响Fig 5 Effect of Gubi Tongxiao granules containing serum on mRNA in MC3T3-E1

表6 骨痹通消颗粒含药血清对mRNA 的影响（n=3，±s）Tab 6 Effect of Serum containing Gubi Tongxiao Granules on mRNA（n=3，±s）

表6 骨痹通消颗粒含药血清对mRNA 的影响（n=3，±s）Tab 6 Effect of Serum containing Gubi Tongxiao Granules on mRNA（n=3，±s）

注：与对照组相比，**P＜0.01；与模型组相比，##P＜0.01。

组别剂量mRNA对照组模型组-10-7M Dex Beclin-1 1.010±0.200 7.030±0.530**Bax 1.020±0.080 1.790±0.100**Bcl-2 1.007±0.025 0.260±0.040**10-6M Dex 9.110±0.456**2.130±0.150**0.230±0.030**10-5M Dex 10-7M Dex+GBTX 10-6M Dex+GBTX 10-5M Dex+GBTX 0.200±0.030**0.940±0.040##0.920±0.060##0.843±0.031##292.408＜0.01实验组FP--3.757±0.695**1.297±0.270##1.437±0.410##1.777±0.366##156.934＜0.01 2.340±0.120**1.120±0.120##1.220±0.070##1.360±0.060##74.707＜0.01

3 讨论

GCs 广泛应用于抗炎及免疫调节等方面。尤其是近年来非典及新冠疫情的出现，GCs 被大量适用于临床。然而，骨丢失甚至股骨头缺血性坏死等副作用可能会抵消其治疗带来的益处［15］。SANFH病程进展快速，关节损毁，最终需通过人工髋关节置换治疗，然而人工关节假体的耐受性及可修复性在一定程度上限制了其适用范围［16，17］。因此，针对早中期的SANFH 的治疗方案仍以保髋为主，即通过药物、保护性负重或手术等方法修复病变的股骨头，保留患者自身髋关节，避免或推迟行人工髋关节置换术［18，19］。

大多数学者认为，GCs 引起股骨头坏死与缺血诱导的细胞凋亡密不可分［20，21］。一方面，大剂量或长期使用GCs 会直接损伤内皮细胞，引起血管凝血纤溶，股骨头局部血液微循环障碍，最终导致SANFH 的发生；另一方面，长期使用GCs 时，细胞内的溶酶体将会广泛地回收细胞器，并可能进一步引起细胞凋亡。先前有研究表明［22］，自噬可能是成骨细胞抵御GCs 负面影响的主要机制。Belin-1 作为自噬发生的标志物之一，是第III 型PI3 激酶（PI3K III）复合物的一部分，参与自噬前体的形成，并介导其他自噬蛋白在自噬前体的定位［23］。研究证实，Beclin1/Bcl-2 复合体对细胞自噬与凋亡转归具有重要的调节作用。当 Beclin-1 与Bcl-2 结合时可竞争性地抑制Bax 与Bcl-2 的结合，导致Bax/Bcl-2 比值升高，促进细胞凋亡。但当促凋亡蛋白竞争性结合Bcl-2 时，Beclin-1 被释放，从而诱发自噬、抑制细胞凋 亡［24］。Han 等 实 验 发 现［25］，抑 制 自 噬 能 够 增 加GCs 环境中促凋亡蛋白Bax 的表达量，导致MC3T3-E1 细胞成骨分化功能障碍，并引起细胞凋亡。而在与自噬诱导剂联合治疗后产生了相反的结果。然而，当压力持续较长时间，特别是在慢性GCs 治疗下，细胞自噬水平反而受到抑制，细胞凋亡途径被激活［26］。这说明自噬不是始终具有保护作用，调控自噬可能在长期摄入GCs 期间对成骨细胞的功能起重要作用［27］。

在本实验中，MC3T3-E1 细胞在GCs 环境中数量减少呈时间和剂量依赖性，自噬标记物Beclin-1水平的增高是从低剂量（10-7M）开始的，最大反应出现在10-6M Dex 诱导的细胞中，当暴露于10-5M Dex时，Beclin-1 的表达量显著降低。Jia 等［28］研究发现，当被低剂量GCs 处理时，骨细胞自噬程序的激活有利于促进细胞存活；然而，更高和持续的压力可能会产生大量自噬体，进而激活细胞凋亡途径，导致细胞大面积凋亡。Zhu 等［14］实验发现， 在骨细胞系MLO-Y4 细胞中，Dex 对细胞自噬的诱导以时间依赖性方式增加。自噬标志物（LC3-II 和 Beclin-1）在低剂量的下增加，在高剂量下减少，并且随着自噬的发生，促凋亡蛋白Caspase-3 的表达明显升高。这与本文的研究结果一致，MC3T3-E1 细胞经高浓度Dex（10-5M）诱导72 h 后，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达量显著降低，相反的促凋亡蛋白Bax 的水平显著升高。这说明GCs 对成骨细胞自噬与凋亡具有双向诱导作用，低剂量的GCs 可以激活自噬，清除受损的细胞器并维持细胞的自我稳态，而长期或大剂量使用GCs 则会抑制自噬，导致细胞凋亡。

中医学认为股骨头坏死属于“骨痹”、“骨蚀”的范畴。激素为药邪，进入人体后可对经络产生影响，气血运行不畅，易伤肝肾；肝肾亏损，主骨生髓乏源，骨失所养，最终发为“骨蚀”［29］。研究表明，补肾活血类中药用于治疗股骨头坏死，不仅具有鲜明的特色，而且疗效确切。朱嘉敏等［30］研究发现，使用骨蚀宁胶囊联合唑来膦酸治疗早中期ONFH 患者能够有效改善患者Harris 评分和疼痛，延缓股骨头塌陷。梁学振等［31］实验表明补肾活血胶囊含药血清能够提高骨髓间充质干细胞成骨分化水平并抑制其成脂分化，促进股骨头坏死区骨修复及新骨的生成。Waqas 等［32］发现葛根素能够上调抗Bcl-2蛋白的表达，有效防止细胞凋亡，维持骨量。Chen［8］等研究发现桃红四物汤通过调节动物模型VEGF的表达及显著抑制细胞凋亡，能够有效延缓股骨头坏死的进程。本实验中，损伤后的MC3T3-E1 细胞经骨痹通消颗粒含药血清干预后，自噬率得到不同程度抑制，且呈剂量相关性。PI 染色半定量结果表明丧失完整细胞膜的红色荧光明显减少。除此外，Bcl-2 的mRNA 表达较模型组明显上升，而Beclin-1与Bax 的mRNA 表达受到抑制。研究表明，Bcl-2不仅能与Bax 结合干扰线粒体依赖性细胞凋亡过程，而且能通过与Beclin-1 的BH3 域结合并影响其活性，抑制Beclin-1 依赖性自噬，降低细胞自噬水平［33］。

综上所述，骨痹通消颗粒能够调控自噬与凋亡的交叉因子Bcl-2，下调Beclin-1 及Bax 的表达量，有效减少细胞自噬及凋亡，从而发挥治疗SANHF 的作用。然而，复方颗粒成分多且复杂，今后仍需要开展更细化的机制研究，以找到治疗疾病靶点的有效成分。同时，还需要更多的动物实验来验证其有效性，以发挥其防治骨坏死疾病的独特优势。

作者贡献度说明：

实验设计：周正新；实验指导与评估：顾一帆、朱磊；实验实施：朱彩玉、侯文渊、韩世鼎；资料收集与统计：徐寰；朱彩玉成文，周正新审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。