袁静静,郑宇钊,殷婷婕

(中国药科大学 药学院,江苏 南京 210000)

几乎基因组中的任何序列以及转录组中的每个编码和非编码RNA都有可能通过将外源核酸引入细胞进行调节以用于治疗目的[1]。在过去的二十年中,已经研究了基于基因的疗法在治疗或预防多种疾病方面的临床应用[2]。然而,由于核酸在体内外稳定性差,递送效率低,极大限制了其成药性。

基因治疗的一个基本挑战是开发安全有效的递送载体,目前核酸药物递送载体可以分为病毒载体和非病毒载体。事实上,迄今为止进行的基因治疗临床试验中,约70%使用了逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAVs)等修饰病毒来递送核酸药物[3]。尽管它们大大推进了基因治疗领域,但病毒载体仍存在一些局限性,比如免疫原性、有限的核酸包装和载体生产的困难。不同于病毒载体,非病毒纳米载体易于制备,具有较低的免疫原性和致癌性[4]。这些制备的纳米颗粒可以保护核酸免受核酸酶降解,增强核酸药物的稳定性,提高其递送效率[5]。在这篇综述中,我们详细介绍了基于脂质的纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、无机纳米颗粒、外泌体和核酸偶联物等非病毒递送系统的最新进展。

1 基于脂质的纳米粒

基于脂质的纳米递送系统是使用最广泛的非病毒核酸递送载体,包括脂质体、固体脂质纳米粒和胶束[6]。基于脂质的纳米颗粒具有制备简单、生物相容性高和免疫原性低等优点,并且可以通过改变脂质组成来实现纳米结构的多功能性[7]。目前,基于脂质的非病毒核酸递送系统已经被应用于多种疾病的治疗。

脂质体本质上是由具有极性头部和非极性尾部的磷脂双层以及稳定剂(如胆固醇)组成。由于其两亲性,可以自发地自组装成囊泡[8]。由经典阳离子脂质组成的脂质体,如DOTMA、DOTAP和DOPE,已被有效地用于递送多种核酸药物。脂质体可用于封装大小从几个核苷酸到几百万个核苷酸不等的核酸药物,以输送到细胞中。较小的脂质体更有可能逃脱吞噬细胞的摄取(≤100 nm)[9]。然而,纳米粒子表面的正电荷可能会导致血清蛋白的非特异性结合和免疫刺激。为此,开发了聚乙二醇化阳离子脂质体作为替代品。脂质纳米粒(Lipid nanoparticles,LNP)由可电离的阳离子脂质(ionizablelipids)、中性辅助脂质、胆固醇、聚乙二醇修饰的脂质(PEGylatedlipid)构成[10]。其中可电离脂质在保护核酸免受核酸酶降解方面发挥主要作用;此外,辅助脂类,如磷脂和胆固醇,可以促进制剂稳定性和膜融合;PEG化脂质可以延长半衰期和增加稳定性[11]。不同于脂质体,脂质纳米粒的内核区域呈胶束结构;此外,与脂质体相比,LNPs表现出更好的动力学稳定性和更坚硬的形态。可电离的LNPs在生理pH值下具有近中性的电荷,但可电离脂质上的胺基在低pH值时变得质子化并带正电荷,从而允许与核酸上带负电荷的磷酸基团组装。络合后,可以将pH值调节到中性或生理pH值,以便进行给药。体内注射后,可电离的LNPs可以从血液中渗出到靶组织。然后LNPs可以吸附到细胞表面,并通过内吞进入细胞。带正电荷的可电离脂质有助于内体逃逸,并与内体脂膜上的负电荷相互作用,从而导致内体不稳定,促进核酸释放[4,12]。首个获得批准的RNA干扰(RNA interference,RNAi)治疗药物使用了LNPs递送系统。然而,脂质纳米粒在储存运输和使用等方面还存在不足之处,比如需要在低温下才能长期保存。

2 聚合物纳米粒

阳离子聚合物是另一种常见的非病毒核酸递送载体。制备聚合物纳米粒可以使用天然聚合物,壳聚糖、右旋糖酐和环糊精,或用合成聚合物,如聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)、聚酰胺(PAMAM)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。它们结构的一个共同特征是分子中存在许多带正电的基团,可以通过静电相互作用与核酸结合,并将其浓缩成小的纳米颗粒[13]。由于它们易于合成和功能化,以及它们的结构多功能性、合成放大的能力、高转染效率、基因免疫原性和优异的生物相容性,聚合物纳米粒是用于递送核酸药物最常用的人工材料之一。纳米胶囊和纳米球是两种最普遍的聚合物纳米粒类型。这两种形式都可以分为多种亚类,包括多聚物、多聚体和树枝状聚合物[14]。

多聚物由阳离子聚合物组成,如PEI、壳聚糖和可生物降解的聚酯。这些阳离子聚合物附着在NAs上,并通过静电力使其凝结成微小、致密的结构。缩合过程是由熵驱动的,当阳离子聚合物与核酸药物结合时,多聚物的产生会自发发生[15]。当制备这些纳米粒时,通常所使用的阳离子聚合物要多于核酸,这使纳米粒具有正的表面电荷。通过被聚合物包围并封闭在聚合物基质中,可以保护核酸不被酶降解。

被称为“多聚体”的聚合物囊泡在形态上类似于基于脂质的囊泡,由两亲性嵌段共聚物产生。两亲性嵌段共聚物的自组装形态由其亲水性分数(Fhydrophilic)决定。制备多聚体的大多数方法来源于脂质体制备方法[16]。主要包括直接溶解共聚物、成膜再水合、交换溶剂和超声处理。亲水性的核酸药物,如质粒DNA、寡核苷酸和小干扰RNA,可以被包封在聚合物囊泡的亲水性核心。

树枝状聚合物是一类大分子,既有广泛的分支,又在大小和形状上是均匀的。它们的基本结构由中心核心、重复分支单元和提供适应性表面功能的端基组成[17]。通过增加重复分支单元的数量来控制树枝状物的产生和随后的球形,其表面或内腔上的疏水或静电相互作用允许药物和核酸的结合。树枝状聚合物由于几个独特的特征而优于其他阳离子聚合物。树枝状聚合物由于其丰富的阳离子电荷而有助于核酸分子的络合,结构中的叔胺具有高质子海绵容量,这有助于核酸分子的内体逃逸,从而增强核酸的治疗效果。此外,树枝状聚合物的表面修饰可以进一步提高包封的治疗部分的安全性和稳定性。

3 无机纳米颗粒

无机材料比有机材料更稳定,免疫原性更低,并且易于合成和修饰,因此它们也经常被用作基因载体。1960年,第一个基于磷酸钙的非病毒基因递送载体被报道。经过几十年的发展,无机载体涵盖了更广泛的范围,包括常见的金纳米颗粒、介孔二氧化硅纳米颗粒和氧化铁纳米粒。

金纳米粒子由于其独特的物理化学性质,如发达的表面化学、较低的免疫原性和可忽略的细胞毒性,作为非病毒基因递送载体受到了广泛关注[18]。金纳粒与核酸可以通过共价或非共价偶联。核酸链与AuNPs核(13～15 nm)的共价键是通过硫醇基团实现的[19]。这种方法使用DNA和siRNA都可以精确地连接到金芯或聚合的金芯。AuNPs表面可以通过在其表面的聚阳离子(如PEI或PAMAM)和阴离子核酸药物之间交替涂覆。为了促进纳米粒与细胞表面受体的特定相互作用和附着,还可以将靶向配体修饰到纳米粒的表面。NP的有效靶向需要考虑配体的大小、密度、疏水性和亲和力等因素。

介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNP)由于其大的负载能力、化学可改性的表面、高的表面积和无毒的特性,已被广泛用作各种生物分子或药物的有效细胞内递送的载体[20]。通常,核酸分子通过弱的非共价相互作用被装载到二氧化硅纳米颗粒中。孔的大小和表面官能化程度对核酸负载量及释放率起着至关重要的作用。具有小孔的二氧化硅纳米颗粒可以为小分子核酸提供可调的释放速率,而较大的孔可以提供更高的负载能力和更快的释放速率。例如,直径为100 nm,孔径2.5～5 nm的二氧化硅纳米颗粒适合于传递小的siRNA,而直径为250 nm、孔径超过15 nm的二氧化硅纳米颗粒用于装载大的pDNA。通过共价修饰过程,二氧化硅纳米粒的负电荷表面可以变成阳离子表面,这可能会对货物的装载方式、蛋白质如何黏附在其上以及释放速度产生重大影响。PEI、树枝状阳离子聚合物已被用于修饰二氧化硅纳米颗粒的表面,使其能够吸引和负载核酸药物。

氧化铁纳米粒子(IONPs)是磁性Fe3O4或Fe2O3纳米晶体,可利用与外部磁场的相互作用开发磁触发药物递送系统[21]。由于在特定尺寸下的超顺磁特性,IONPs成功地作为核酸药物治疗的递送载体。它们具有最小的毒性、在表面捕获生物分子的能力、低的生产成本以及使用外部磁体直接靶向的能力,这使其成为核酸药物递送应用的优秀纳米材料。然而,当IONPs用作药物载体时,必须对其进行表面修饰以提高其胶体稳定性。

4 外泌体

外泌体是生物来源的膜结合纳米级囊泡,已知含有各种分子,例如蛋白质、脂质和核酸,它们有助于外泌体介导细胞间通讯的能力[22]。近年来,外泌体被认为是一种高效且有前途的核酸药物递送载体。与脂质纳米颗粒和其他传统的合成递送系统相比,外泌体具有以下优势:(1)外泌体具有相对较低的细胞毒性和免疫原性,因为它们是蛋白质、核酸和脂质等货物的天然载体,并且由于纤连蛋白等膜蛋白,它们具有更好的生物相容性。(2)外泌体在体内循环的时间比LNPs长,在血浆中表现出高稳定性,而LNPs更有可能被巨噬细胞或网状内皮细胞清除[23]。例如,Kamerkar等人发现[24],通过外泌体膜上CD47和信号调节蛋白α(SIRPα)的结合,外泌体可以逃脱巨噬细胞的清除。他们还比较了外泌体和LNPs的递送效率,发现外泌体在循环中的滞留时间更长。(3)外泌体可以通过多种机制穿过血脑屏障(BBB)。相比之下,如何用LNP有效地将货物运送到中枢神经系统一直是一个难题。

然而,外泌体递送核酸药物目前还有许多挑战。首先,最重要的挑战是大规模生产具有高质量和良好特性的外泌体。第二个挑战是提高将核酸药物装载到外泌体中的效率并促进其靶向效率。第三个挑战是在临床试验中评估治疗性外泌体的安全性、免疫原性和生物分布。为了实现临床应用,首先目前的外泌体分离和纯化方法仍需优化和精简,以实现高效、经济高效和可重复的生产;其次,为了提高外泌体中的治疗性RNA水平,应该开发有效的新装载策略;最后,需要进行一系列临床前研究,如药效学和毒性检查,以防止潜在的安全问题,并将副作用降至最低。

5 核酸偶联物

核酸偶联物是通过将递送配体共价连接到核酸药物上制备而成,通过偶联分子(胆固醇、多肽、抗体、核酸适配体等)改变核酸药物的体内分布及代谢动力学等性质,帮助核酸进入到特定的组织和细胞内[25]。目前已经开发了几种有前景的递送系统,最先进的偶联物平台是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)偶联物,获得批准进入临床应用的GalNAc技术核酸药物已有3款[26]。核酸偶联物受益于具有最小递送材料和明显宽的治疗窗口的明确结构,并且在提高其效力方面不断取得进展。

但核酸偶联物仍然面临一些递送挑战,如何增强核酸分子在生理环境中的稳定性是其面临的关键问题[27]。此外,设计核酸偶联物时需考虑分子间连接子的设计及修饰位置。首先,所选择的连接子在偶联核酸分子和载体时不会破坏它们的结构;第二,连接子需要在细胞外具有高稳定性,以防止血液循环过程中携带的核酸分子丢失;最后,用于偶联的连接子不会影响核酸分子的性质,并且可以使核酸分子在进入靶细胞后与偶联物脱离。目前报道的连接子有二硫键、酰胺键、硫醚键和硫醇-马来酰亚胺键等。其中二硫键是一种常用于偶联化学键,易于生成,通常在细胞外表现出良好的稳定性,在细胞质中相对较高的还原性环境很容易被破坏,进而释放偶联的核酸分子。Cheng[28]等人设计了一个拮抗miR-155的短antimiR-155序列,并通过二硫键将其偶联到低pH值插入肽(pHLIP)上。该缀合物可以靶向实体瘤的酸性环境(pH值约为6)并有效抑制淋巴瘤模型中的miR-155基因的表达。

6 总结与展望

近年来,非病毒纳米载体在基因治疗中的应用得到迅速发展,与病毒载体相比,非病毒纳米载体具有许多优点,包括生物安全风险低、材料来源丰富、可以进行多种生物功能修饰、易大规模生产等。

尽管非病毒纳米载体在基因治疗方面具有巨大潜力,但其在临床应用仍面临诸多挑战。首先是负载核酸药物的纳米载体向靶细胞的有效转运。纳米载体在递送核酸药物过程中存在众多生物屏障。第二个挑战是对纳米颗粒的合成和功能化进行有效和精确的控制。每批纳米颗粒的尺寸、表面理化性质、灵敏度和特异性应该更加可控。此外,纳米载体的体内生物行为和毒性也是限制其临床转化的主要问题。因此,非病毒基因治疗的广泛应用仍需要进一步研究来解决这些问题,并充分发挥核酸药物治疗的潜力。随着科学研究领域跨学科研究的兴起,相信新开发的非病毒核酸递送系统将越来越安全有效。