王 丹，江春阳，邓乔晟，杨 勤 ，周 浓,

（1.重庆三峡学院生物与食品工程学院，三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 404120；2.重庆三峡医药高等专科学校，重庆 404120）

地参（Lycopus lucidus）又名虫草参，银条菜，地蚕子，是唇形科地笋属多年生草本植物，其形状、营养与人参相似[1]。在《中华本草》资料中记载了地参可作为蔬菜食用，其晒干之后还可以入药，功能与冬虫夏草相当[2]。药理研究表明[3]，地参中含有大量的多酚类和多糖类，具有降血糖、抗氧化、抗肿瘤等疗效作用。地参可作为蔬菜食用，其保健功能丰富，享有“蔬菜珍品”、“山中之王”等美誉[4]。

目前国内外对地参药理研究主要集中在地参多糖、多酚等成分的提取研究[5−7]，现有的对地参的工艺研究包括地参酸奶[8]、地参酸辣发酵羊蹄[9]、地参枸杞汁[10]等休闲食品，没有关于用鲜地参进行发酵酒的研究报道。针对目前市场上的地参加工成品，加工方法略微粗放，工业化程度较低，其产品质量稳定难以控制[11]。地参作为药食兼用的植物，营养成分丰富，保健功能明显，有着很大的开发利用价值，且地参含有大量的糖类物质，可作为酿造保健型发酵酒的良好原材料。因此，有必要对地参开展深加工技术，开发利用地参中的其它活性成分，提升地参产品附加值。

本研究以新鲜地参为原料，通过单因素和响应面试验来确定地参发酵酒的发酵工艺条件，并对其体外抗氧化活性和酚酸类物质进行分析，旨在酿造出一款口感佳、营养丰富、具有地参典型风味的地参发酵酒，为地参的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜地参 重庆市万州区恒合乡石桶寨村种植地；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DY9 自筛选地参发酵酒专用酵母菌；酵母浸出粉葡萄糖培养基（YPD液体培养基） 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；DPPH（2,2-联苯基-1-苦基肼基）、ABTS西亚化学科技（山东）有限公司；没食子酸、芦丁北京索莱宝科技有限公司；丹参素、对羟基苯甲酸、咖啡酸 成都曼思特生物科技有限公司；原儿茶酸上海源叶生物科技有限公司；白砂糖 重庆野山珍商贸有限公司；甲醇（色谱纯） 德国默克公司；氢氧化钠、过硫酸钾、苯酚、硫酸等试剂 成都市科隆化工试剂厂，均为分析纯。

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色谱仪美国Waters公司；L18-Y915S型高速破壁调理机九阳股份有限公司；PHS-3C型精密酸度计 杭州齐威仪器有限公司；酒精计 衡水创纪仪器表有限公司；FA1004型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；YRE-2000A型旋转蒸发仪 巩义市予华仪器有限公司；V-1200型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；HSY-26型水浴锅、HDPN-Ⅱ-256型电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 地参发酵酒的工艺流程和操作要点 地参发酵酒的工艺流程如图1所示，操作要点如下：

图1 工艺流程图Fig.1 Process flow chart

地参汁制备：挑选新鲜无病害的地参清洗，备用。新鲜地参按一定的料液比（1:2）榨汁，按地参汁总质量的0.1%添加果胶酶，40 ℃酶解2 h；添加焦亚硫酸钾（80 mg/L），用白砂糖调节糖度，用柠檬酸将pH调至酵母菌最适生长值4～4.5；

酵母活化：取自筛的酿酒酵母DY9，划线于YPD固体培养基上，28 ℃培养48 h，挑取单个菌落接种于YPD液体培养基中，于28 ℃的摇床振荡培养20 h，将1 mL菌液接入100 mL YPD液体培养基中，连续扩增。

发酵：将调整好成分的地参汁放入发酵瓶（500 mL）中，在水浴70 ℃下杀菌30 min，冷却至室温，接入活化好的酵母，使用硅胶塞单向阀盖好发酵瓶，按试验设计的发酵时间、温度进行发酵，发酵结束后，用4层纱布过滤去除发酵残渣，得到的酒液放置14～18 ℃下低温陈酿2个月。

灭菌：采用巴氏灭菌法，将澄清处理后的地参发酵酒置70 ℃热水中20 min。

1.2.2 单因素实验设计

1.2.2.1 酵母接种量 设不同酵母接种量为2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%，发酵温度24 ℃，初始糖度22%，发酵时间9 d，发酵结束后测定发酵酒的酒精度和残糖含量，研究不同酵母接种量对发酵酒品质（酒精度和残糖量）的影响。

1.2.2.2 发酵温度 设不同发酵温度为19、22、25、28、31 ℃，酵母接种量5%，初始糖度22%，发酵时间9 d，发酵结束后测定发酵酒的酒精度和残糖含量，研究不同发酵温度对发酵酒的品质影响。

1.2.2.3 初始糖度 设不同初始糖度为18%、20%、22%、24%、26%，酵母接种量5%，发酵温度24 ℃，发酵时间9 d，发酵结束后测定发酵酒的酒精度和残糖含量，研究不同初始糖度对发酵酒的品质影响。

1.2.2.4 发酵时间 设不同发酵时间为3、5、7、9、11 d，发酵温度24 ℃，初始糖度22%，酵母接种量5%，发酵结束后测定发酵酒的酒精度和残糖含量，研究不同发酵时间对发酵酒的品质影响。

1.2.3 响应面试验设计 在单因素实验的基础上，选择发酵温度（A）、酵母接种量（B）和初始糖度（C）三个影响因素，以感官评分、酒精度为响应值，采用Box-Behnken中心组合设计原理设计响应面试验[12−14]，试验因素及水平编码见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels for response surface experiment

1.2.4 理化指标测定 按照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中酒精计法进行酒精度的测定[15]；总酸（以柠檬酸计）：按照GB/T 12456-2021《食品中总酸的测定》中的pH计电位滴定法测定[16]；残糖量的测定：采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法[17]；总酚含量的测定：采用Folin-Ciocaltue法[18]，以没食子酸为对照品，标准曲线为y=1.5482x+0.4538，R2=0.9995；黄酮含量测定采用NaNO2-Al（NO3）3方法[19]，以芦丁为标准品，标准曲线为y=10.541x−0.027，R2=0.9998；多糖含量的测定采用硫酸-苯酚比色法[20]，以葡萄糖为标准品，标准曲线为y=0.121x−0.0005，R2=0.9989。

1.2.5 感官评价 随机选择10名食品专业人员，从地参发酵酒的外观、滋味、香气、典型性4个指标进行评定，满分100分，感官评分结果取平均值。感官品评表见表2。

表2 地参发酵酒感官评分标准Table 2 Standard of sensory evaluation for Lycopus lucidus fermented wine

1.2.6 地参发酵酒抗氧化能力的测定 将酒样稀释10倍后，吸取1.0 mL样品于刻度试管中进行实验。DPPH自由基清除能力的测定：参考苏龙等[21]的测定方法稍作修改；ABTS+自由基清除能力的测定：参考Miriam等[22]的方法稍作修改；对羟自由基清除能力的测定：参考万景瑞等[23]的方法稍作修改；以上方法均以0.1 mg/mL的VC为阳性对照，计算公式为：

式中：A1为样品溶液吸光度；A2为本底吸光度；A0为空白溶液吸光度。

1.2.7 地参发酵酒酚酸类物质的测定 对照品溶液的制备：分别精密称取没食子酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丹参素、原儿茶酸对照品适量，置于10 mL棕色容量瓶中，加80%甲醇溶解并定容至刻度线，得到浓度分别为0.709、1.2、1.426、0.204、0.448 mg/mL的对照品贮备液，于4 ℃冰箱保存，备用。

样品溶液的制备：参考朱霞建等[24]的方法并稍作修改。取地参发酵酒20 mL，用1 mol/L NaOH 调节pH为7左右，加入20 mL乙酸乙酯反复萃取3次，合并上清液，40 ℃ 旋转蒸发浓缩至干，用甲醇复溶并定容至2 mL，过0.22 μm有机滤膜上机测定。

色谱条件：参考唐柯等[25]的方法并稍作修改。以ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）为色谱柱；以0.1%磷酸为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱（0～4 min，10%～20% B；4～9 min，20%～40% B；9～10 min，40%～10% B；10～12 min，10% B）；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；检测波长280 nm；进样体积1 μL。

1.3 数据处理

全部试验重复3次，数据处理及分析采用Excel 2010。响应面试验设计及结果分析采用Design-Expert 8.0.6.1软件，用Origin 2021绘图软件绘制试验结果图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 酵母接种量对地参发酵酒的影响 不同酵母接种量对地参发酵酒精度及残糖量的影响结果见图2。由图2可知，随着酵母接种量的增加，酒精度出现先升高后降低的现象，当酵母接种量为5%时，酒精度出现了最大值，残糖含量最低。当酵母量超过5%时，酒精度降低的同时残糖量也略微增高，可能是因为酵母接种量过多，酵母生长代谢旺盛，会消耗发酵液中大量营养物质，影响了微生物的发酵导致酒精产量低[26]。当酵母接种量少时，发酵的速度慢，容易产生杂菌，从而影响发酵酒的口感[27]。经发酵酒精度及残糖含量综合考虑，选择酵母接种量为4%、5%、6%进行响应面试验。

图2 酵母接种量对地参发酵酒酒精度和残糖量的影响Fig.2 Effects of yeast inoculation on the alcohol content and residual sugar of L. lucidus fermented wine

2.1.2 发酵温度对地参发酵酒的影响 不同发酵温度对地参发酵酒精度及残糖量的影响结果见图3。由图3可知，在19～25 ℃温度范围内时，随着温度的增加酒精度也升高。温度为25 ℃时酒精度达到了最大值，残糖含量最低。当温度在超过25 ℃时，发酵生成的酒精度呈下降趋势，残糖含量逐渐增多，发酵温度过高，酵母菌繁殖速度加快，容易使菌体提前衰老，不利于糖转化为酒精，温度高发酵物中风味物质易挥发，影响发酵酒的口感。经发酵酒精度及残糖含量综合考虑，选择发酵温度为22、25、28 ℃进行响应面试验。

图3 发酵温度对地参发酵酒酒精度和残糖量的影响Fig.3 Effects of fermented temperature on the alcohol content and residual sugar of L. lucidus fermented wine

2.1.3 初始糖度对地参发酵酒的影响 不同初始糖度对地参发酵酒精度及残糖量的影响结果见图4。在发酵的过程中酵母菌利用糖进行生长繁殖，并将糖转化为酒精。由图4可知，随着初始糖度的增加，酒精度呈现出先升高后降低的情况，残糖含量在逐渐的增加。初始糖度太低，生成的酒精度低，酒的口感寡淡。初始糖度含量过多会增加发酵液的渗透压，酵母菌代谢活动会受到抑制，多余的糖未能转化为酒精导致酒精度降低，发酵酒中的剩余糖量过多，从而影响了发酵酒的口感[28]。当初始糖度为22%时，发酵酒的酒精度、残糖含量适中。因此，经发酵酒精度及残糖含量综合考虑，选择初始糖度为20%、22%、24%进行响应面试验。

图4 初始糖度对地参发酵酒酒精度和残糖量的影响Fig.4 Effects of initial sugar content on alcohol content and residual sugar of L. lucidus fermented wine

2.1.4 发酵时间对地参发酵酒的影响 发酵时间过短或过长都会对酒的品质造成影响。由图5可知，当发酵时间为3 d时，酒精度最低，残糖量最高；在发酵时间3～9 d的范围内时，酒精度随着时间的延长而增加，这个阶段残糖量下降迅速。发酵时间为9 d时，酒精度的增长最快，酒精度达到了最大值，在9～11 d时酒精度基本不再生长，残糖量下降缓慢。发酵后期，发酵液中剩余的营养成分较少，酵母的生长受到了抑制，部分酵母衰老[29]。经发酵酒精度及残糖量综合考虑，加上时间的成本选择时间9 d为最佳发酵时间。

图5 发酵时间对地参发酵酒酒精度和残糖量的影响Fig.5 Effects of fermented time on the alcohol content and residual sugar of L. lucidus fermented wine

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果 根据单因素实验结果，以发酵温度（A）、酵母接种量（B）和初始糖度（C）为自变量，分别以酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为因变量进行Box-Benhken响应面优化设计试验，试验结果见表3。

利用Design Expert 8.0.6.1软件对表3数据进行二次回归方程拟合，分别得到酒精度（Y1）和感官评分（Y2）对发酵温度（A）、酵母接种量（B）和初始糖度（C）的二次多项回归方程：

表3 地参发酵酒工艺优化响应面试验设计及结果Table 3 Experimental design and results of optimized response surface of Lycopus lucidus fermentation wine process

方差分析结果显示，所得回归模型极显著（P<0.01），失拟项不显著（P>0.05），证明所得模型能充分拟合试验数据，能够较好的预测试验值，详见表4。由P值结果得出3种因素对地参发酵酒酒精度影响的强弱顺序依次为：初始糖度>发酵温度>酵母接种量。一次项C对酒精度的影响极显著（P<0.01），A、B对酒精度影响不显著；交互项AB、AC、BC对酒精度影响均不显著；二次项A2对酒精度影响显著（P<0.05），B2、C2对酒精度影响极显著（P<0.01）；3种因素对地参发酵酒感官评分影响的强弱顺序依次为：初始糖度>发酵温度>酵母接种量。一次项C对感官评分的影响极显著（P<0.01），A对感官评分的影响显著（P<0.05），B对酒精度影响不显著；交互项AB对感官评分的影响极显著（P<0.01），AC、BC对感官评分影响均不显著；二次项A2、B2、C2对感官评分影响极显著（P<0.01）。

2.2.2 响应面结果分析 响应面是响应值受各影响因子影响程度的三维曲面图，能很好地反映不同影响因子间的相互作用强弱，且响应面图曲面坡度越陡峭、等高线越密集成椭圆形表示两因素交互影响越大[30]。

利用Design Expert 8.0.6.1软件对影响地参发酵酒酒精度和感官评分的3个因素进行交互分析，交互作用的大小由响应面的的陡峭程度来体现。由图6可知，图6A的陡峭度和等高线的密集程度都高于图6B和图6C，证明了AB的相互作用对酒精度的影响要高于AC和BC交互作用的影响，这与表4中AB的P值小于AC和BC的P值相吻合。由图6D～图6F可知，A与B的响应面坡度最陡峭，其等高线呈椭圆，说明AB的交互作用对感官评分的影响较显著，而AC和BC的陡峭程度都不如AB，其高等线密集程度也弱于AB，这与表4中AB的P值小于AC和BC的结论相吻合。

图6 各因素交互作用对酒精度和感官评分影响的响应面图Fig.6 Response surface view of the effect of factor interaction on alcohol content and sensory score

表4 响应面试验方差分析Table 4 Variance analysis of response surface methodology

2.2.3 最佳发酵工艺与验证 通过单因素实验得出最佳发酵时间为9 d，利用Design-Expert 8.0.6.1软件对响应面试验进行结果分析，确定地参发酵酒的最佳发酵工艺条件为发酵温度25.99 ℃，接种量为5.1%，初始糖度为22.78%，此条件下由公式算出的理论酒精度为11.18%vol，理论感官评分为85.38分。根据实际情况，验证试验的条件为发酵温度26 ℃，接种量为5.1%，初始糖度为22.8%，在此条件下，进行3次重复试验，得到地参发酵酒的酒精度为11.23%vol，感官评分为85.50分，测定结果与预测值偏差不大。因此，响应面优化地参发酵酒工艺参数是可靠的。

2.3 地参发酵酒品质评价

2.3.1 地参发酵酒理化指标分析 由响应面优化出的工艺参数发酵，所得到的地参发酵酒体色泽呈橘黄色，澄清透明，酒体醇厚丰满，具有独特的地参酒风味。理化指标，地参发酵酒多糖含量为6.54±0.08 g/L、总酚为384.31±0.12 mg/L、总酸和总黄酮为别为20.67±0.15 g/L和204.59±0.21 mg/L。

2.3.2 体外抗氧化活化 研究发现，地参发酵酒中含有丰富总黄酮、总酚物质，这两种物质有很好的抗氧化能力，能有效地清除体内自由基延缓衰老[31−32]。由图7可知，地参发酵酒对DPPH、·OH、ABTS+都有较强的清除作用，与VC的清除能力相比较，其DPPH自由基清除能力低于VC，·OH、ABTS+自由基清除能力高于VC。

图7 地参发酵酒抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of Lycopus lucidus fermented wine

2.3.3 酚酸类物质含量分析 在响应面试验得到的条件下，测定了地参发酵酒中酚酸物质含量，含量检测结果见表5，液相色谱图见图8。酚酸类物质具有良好的营养功能和抗氧化等药理活性，发酵酒中就含有大量的酚酸类物质[33]。由表5可知，从地参发酵酒中检测到了5种酚酸物质，其中没食子酸的含量最高（11.20 mg/L），占酚酸总量的33.2%，赵宁等[34]研究发现除“徐香”清汁发酵酒外其他5种猕猴桃酒中没食子酸含量最高，其次是咖啡酸，对羟基苯甲酸的含量最低（3.40 mg/L），本研究结果与其类似。没食子酸作为地参发酵酒中的主要酚酸类物质，具有抗炎、抗氧化、抗突变及抗肿瘤等多种生物活性[35]。本研究所得地参发酵酒中酚酸类物质种类较为丰富，具有一定的保健作用。

图8 混合对照品（A）及样品（B）的UPLC图谱Fig.8 UPLC spectra of mixed reference substance (A) and sample (B)

表5 地参发酵酒5种酚酸类物质含量Table 5 Contents of five phenolic acids in Lycopus lucidus fermented wine

3 讨论与结论

地参发酵酒的最佳工艺条件为发酵温度26 ℃，接种量5.1%，初始糖度22.8%，发酵时间9 d，在此条件下得到的地参发酵酒感官评分为85.50分，酒精度为11.23%vol，酿造得到的酒体醇厚丰满或酒体爽口，颜色为橘黄色，澄清透明，具独特的地参酒风味，酒香纯正优雅。地参发酵酒含有丰富的活性物质，多糖、总酚、总酸和总黄酮含量分别为6.54 g/L、384.31 mg/L、20.67 g/L和204.59 mg/L。单体酚酸类物质没食子酸为11.20 mg/L、丹参素为4.38 mg/L、原儿茶酸为3.74 mg/L、对羟基苯甲酸为3.40 mg/L，咖啡酸为11.00 mg/L。地参本身就具有丰富的营养价值和开发价值，本研究所得地参发酵酒酒色泽呈橘黄色，澄清透明，酒体醇厚丰满，不仅具有独特的地参酒风味，同时较好的保留了地参发酵酒多酚等活性成分，并且还具有一定的抗氧化活性。因此，开发地参酒可为今后地参的深加工提供新的思路，同时也增加了地参加工产业的经济效益。