杨路路,周文斌,王劲松,黄文斌,方 媛

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤之一,其发病与遗传、饮食和生活习惯等因素有关,随着人们生活水平的提高,我国CRC的发病率呈逐年上升趋势,转移和复发是患者死亡的主要原因[1]。内镜下活检组织病理检查是早期筛查和诊断CRC的“金标准”,活检病理诊断的精准评估对患者癌症风险预判和个体化治疗具有重要意义。活检标本是从肿瘤浅表区域获取的小块组织,用传统的组织学参数(如浸润深度、脉管神经累犯等)评估肿瘤生物学行为存在较大的局限性,多数活检标本只能评估肿瘤的分化程度。肿瘤出芽是指从肿瘤主体分离出来的单个癌细胞或﹤5个癌细胞簇的组织学形态,肿瘤出芽可能是肿瘤组织侵袭、转移的始发阶段[2-3]。根据出芽部位可分为肿瘤浸润前沿出芽(peritumoural budding, PTB)和肿瘤内出芽(intratumoural budding, ITB)[4-5]。手术切除标本中PTB与CRC侵袭性生物学行为密切相关已被较多研究证实,但目前ITB的临床病理学意义尚不清楚[6-8]。CRC活检标本中的肿瘤出芽由于位于肿瘤内应为ITB,其能否作为术前评估CRC风险分层的临床病理学参数,以及与PTB之间的关系目前国外文献报道甚少,国内尚无相关报道。由于炎症和促纤维间质反应等有时会干扰肿瘤出芽的判断,本实验采用CKpan标记肿瘤细胞,观察144例CRC活检标本和对应手术切除标本中肿瘤出芽形成情况,探讨活检组织中肿瘤出芽与CRC临床病理学参数及预后的关系,为CRC的术前诊治和预后评估提供更可靠的指标。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2016年1月～2017年12月南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)病理科经术前活检及对应根治性手术切除标本诊断为结直肠腺癌144例;其中男性94例,女性50例;年龄27～89岁,平均66岁;肿瘤最大径1～12 cm,平均4.7 cm。所有患者术前均未行放、化疗和免疫治疗。

1.2 方法由两名高年资病理医师采用双盲法浏览每例活检和根治性手术切除标本的所有HE及免疫组化染色切片,评估肿瘤出芽及相关临床病理学参数,活检标本参数:ITB、分化程度;手术切除标本参数:PTB、分化程度、浸润深度、脉管浸润(血管或淋巴管)、神经累犯、淋巴结转移、pTNM分期。当评估意见不一致时,在多头显微镜下同时观察分析并达到统一。所有标本均经10%中性福尔马林固定,常规脱水、石蜡包埋,分别行HE和免疫组化染色。免疫组化染色采用EnVision两步法,所用一抗CKpan及二抗均购自北京中杉金桥公司,所有操作步骤参照试剂盒说明书进行。

1.3 肿瘤出芽评估活检标本中肿瘤出芽的判读参照Rogers等[9]的标准,即肿瘤间质中单个癌细胞或﹤5个癌细胞组成的细胞簇,光镜下(200×,视野面积0.785 mm2)观察有无肿瘤出芽,同时采用CKpan标记肿瘤细胞,对出芽的肿瘤细胞进行确认;手术切除标本中PTB判读方法同上。

1.4 随访随访资料通过电子病历及电话随访获取,随访时间为2016年1月～2021年8月。总生存期(overall survival, OS)为患者接受手术之日至随访截止时间或死亡的时间,无进展生存期(progression-free survival, PFS)为患者从手术之日到癌症发生进展(肿瘤复发、转移)或死亡的时间。

1.5 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析,肿瘤出芽与CRC临床病理学特征的关系采用χ2检验或Fisher精确概率法;活检标本中ITB与手术切除标本中PTB的相关性采用Spearman分析;生存分析采用Kaplan-Meier函数,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC中肿瘤出芽组织学特征活检组织肿瘤内及手术切除标本肿瘤浸润前沿纤维性间质内可见单个或小灶性肿瘤细胞从肿瘤性腺体分离;出芽的肿瘤细胞异型性大,呈多角形或梭形,胞质较丰富、嗜酸性,常发生融合,核深染;免疫组化标记CKpan,可以清楚地观察到出芽的肿瘤细胞(图1～6)。

2.2 活检组织中ITB与CRC临床病理学特征的关系144例CRC活检标本中,ITB 57例,ITB检出率为39.6%,活检组织中ITB与淋巴结转移、pTNM分期、分化程度、脉管浸润及神经累犯密切相关(P<0.05),ITB与患者年龄、性别、肿瘤大小和浸润深度无关(P>0.05,表1)。

2.3 手术切除标本中PTB与CRC临床病理学特征的关系144例CRC手术切除标本中,PTB 93例,PTB检出率为64.6%,手术切除标本中PTB与淋巴结转移、pTNM分期、分化程度、脉管浸润及神经累犯密切相关(P<0.05),PTB与患者年龄、性别、肿瘤大小和浸润深度无关(P>0.05,表1)。

2.4 CRC活检标本与手术切除标本肿瘤出芽的相关性相关性分析显示:活检组织中ITB与手术切除标本中PTB的检出呈正相关(r=0.510,P<0.05,表2)。

2.5 生存分析134例患者获得随访资料,随访时间1～68个月(中位随访时间50个月),死亡39例,生存95例,总生存率为70.90%,无进展生存率为67.16%,其中4例患者发生肺转移、9例肝转移、1例卵巢转移、4例复发。生存分析显示,活检标本中肿瘤出芽组患者平均OS为(40.86±18.45)个月,低于无肿瘤出芽组[(49.93±14.26)个月],且肿瘤出芽组平均PFS为(36.45±12.16)个月,低于无肿瘤出芽组[(48.53±16.06)个月],两者差异均具有统计学意义(POS=0.001、PPFS<0.001),活检组织中ITB与CRC患者的OS和PFS显著相关,患者预后更差(图7、8)。

图7 活检组织中肿瘤内出芽与患者总生存率的关系

图8 活检组织中肿瘤内出芽与患者无进展生存率的关系

3 讨论

肿瘤出芽是一种肿瘤生物学行为,是肿瘤侵袭活动的重要标志,近年来受到越来越多学者的重视[10-13]。肿瘤出芽定义为肿瘤内或浸润前沿间质中呈未分化的单个癌细胞或<5个癌细胞的细胞簇,可分为PTB和ITB。PTB是指肿瘤与正常组织交界处的出芽,在内窥镜、手术切除标本中评估,ITB是指肿瘤主体内的出芽,在手术、活检标本中均可评估[4]。目前研究认为肿瘤出芽模拟肿瘤上皮-间质转化(epithelial-mesenchiymal, EMT)过程获得侵袭转移能力[3]。Brabletz等[14]研究发现,CRC中出芽肿瘤细胞E-cadherin表达下调,同时伴有β-catenin核移位、细胞极性丧失和成纤维母细胞形态的形成;肿瘤出芽还可表达干细胞标志物,如EpCAM和CD44s等[15];因此,肿瘤出芽可能是肿瘤生长或转移的始发阶段,与肿瘤进展密切相关。

国际抗癌联盟(UICC)已正式明确PTB是CRC侵袭性行为与不良预后的一个重要指征[4]。Rogers等[16]Meta分析结果显示,肿瘤出芽是CRC淋巴结转移、癌症复发和5年生存率的不良预后因子。李正勇等[17]研究34例T1N0M0期患者,发现肿瘤出芽是提示CRC经内镜切除治疗后早期复发及转移的危险因素。Ueno等[7]进行了一项多中心研究,结果发现肿瘤出芽分级与肿瘤T分期、脉管浸润、神经累犯及CEA指标等密切相关,出芽级别与肝、肺、淋巴结和腹膜转移显著相关,多因素分析显示,肿瘤出芽是CRC患者RFS独立的预后因子,还可以预测Ⅱ期CRC患者新辅助化疗的治疗效果。本组前期研究结果也进一步证明PTB与CRC不良病理参数显著相关[18]。

目前CRC活检标本中肿瘤出芽的研究不如手术切除标本研究深入,尚无统一的评估标准。国际肿瘤出芽发展共识(ITBCC)采用热点区计数肿瘤出芽数量进行分级(0～4个为低级别,5～9个为中级别,≥10个为高级别),该方法比较适合手术切除标本中肿瘤出芽的评估;Yamadera等[19]提出2级分级系统,分为“低级别(0～9个)”和“高级别(≥10个)”;Rogers等[9]将活检标本中肿瘤出芽简单地分为“阴性”和“阳性”。由于活检标本组织小,通常不需要多个高倍视野评估,肿瘤出芽较手术切除标本少,本实验采用有、无肿瘤出芽进行分组,该方法在活检标本中评估肿瘤出芽具有较好的实用性。本实验主要探讨活检组织中肿瘤出芽的临床意义,对于其评估的最佳方法有待进一步研究。尽管肿瘤出芽在HE染色下即可观察,但有时因炎症及促纤维间质反应等干扰肿瘤出芽的识别,因此在形态学难以辨认的病例中行CKpan免疫组化染色可以清楚地显示出芽的肿瘤细胞,从而减少对肿瘤出芽的误判或漏判。

本组活检标本中ITB与CRC淋巴结转移、病理分期、分化程度、脉管浸润和神经累犯等密切相关,活检组织中检出肿瘤出芽者更易发生脉管内癌栓、神经累犯及淋巴结转移,肿瘤分级、分期也更高;且发现活检标本中ITB与对应手术切除标本中PTB之间存在较强的正相关性,与Zlobec等[20]研究结果一致。Zengin等[21]对82例接受术前活检及手术切除的早期直肠癌(pN0)中肿瘤出芽进行研究,发现高级别肿瘤出芽与淋巴管内癌栓、神经累犯、高级别pT分期、侵袭性浸润方式及周缘阳性等显著相关,是判断早期CRC淋巴结及远处转移的危险因素。Giger等[22]研究也显示活检标本中高级别肿瘤出芽对CRC淋巴结受累及远处转移具有较高的灵敏度及阳性预测值。本实验生存分析亦显示,活检标本中肿瘤出芽患者的OS低于无肿瘤出芽者,且PFS较无肿瘤出芽患者明显缩短,肿瘤出芽患者更易发生局部复发和远处转移。上述研究结果高度提示活检组织中肿瘤出芽现象在一定程度上反映了肿瘤主体的生物学行为,与肿瘤的侵袭性和不良转归密切相关。

国外有研究发现[9],活检组织中肿瘤出芽是CRC新辅助放、化疗不良肿瘤退缩及患者不良预后的标志,有可能成为患者避免新辅助放、化疗的一个指标。Hatthakarnkul等[23]Meta分析显示,高级别肿瘤出芽与KRAS突变和MSS/pMMR状态显著相关,这表明KRAS突变和MSS状态在肿瘤出芽及肿瘤发展中发挥着重要作用。结合文献和本实验结果表明,在CRC活检标本中评估肿瘤出芽有助于预测CRC的生物学行为,从而指导临床选择合适的治疗方案。

综上所述,活检标本中ITB与对应手术切除标本中PTB之间存在强相关性,ITB的检出与肿瘤主体不良病理学特征密切相关,活检组织中出现肿瘤出芽有望成为CRC术前管理的生物学标志物,有助于CRC患者的个体化治疗及预后评估。