凡龙云,彭 薇,王美玲,赵雅丽,肖 寒,王万祥,吴 强,,王 弦,

甲状腺癌是甲状腺最常见的原发性恶性肿瘤,甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinomas, PTC)是原发性甲状腺癌中最常见的类型[1]。虽然PTC预后良好,但仍有20%～30%的PTC患者出现复发,约7%患者死亡[2]。有时甲状腺乳头状增生(papillary thyroid hyperplasia, PTH)会表现出与PTC类似的组织学特征,包括发育良好的具有纤维血管轴心的乳头状结构、核拥挤和核分裂象,给PTC的诊断和鉴别诊断带来困难[3]。既往研究和临床诊断实践发现,PTC诊断常用的免疫组化标志物对PTC的诊断准确性尚未达成统一的共识[4]。因此,有必要探索新的免疫组化标志物或组合以提高PTC的诊断准确率。

酸性富含半胱氨酸的分泌蛋白相关的模块化钙结合蛋白-2(secreted modular calcium binding protein-2, SMOC2)属于SPARC家族,在人体多种实体肿瘤中的作用尚有分歧[5]。本研究在生物信息学的基础上,采用免疫组化法检测SMOC2在PTC组织中的表达情况,分析其与PTC临床病理特征的关系及与CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E联合辅助诊断的价值。

1 材料与方法

1.1 材料选取2021年10月～2022年7月安徽医科大学第一附属医院和安徽医科大学第二附属医院病理科具有完整临床病理资料的75例PTC和45例PTH手术切除石蜡标本。排除手术前接受过化疗、放疗或免疫抑制剂治疗以及合并其他恶性肿瘤的患者。所有病例均经10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,4 μm厚连续切片,分别行HE和免疫组化染色。75例PTC中女性50例,男性25例,年龄19～74岁,中位年龄40岁。39例有局部淋巴结转移,36例无淋巴结转移。AJCC第八版甲状腺肿瘤TNM分期:Ⅰ期28例,Ⅱ期44例,Ⅲ期3例。

1.2 试剂SMOC2兔多克隆抗体(GTX85703)购自GeneTex公司;CK19鼠单克隆抗体(UMAB2,即用型)、Galectin-3鼠单克隆抗体(UMAB157,即用型)、MC鼠单克隆抗体(HBME-1,即用型)、DAB显色试剂盒(PV-6000D)均购于北京中杉金桥公司;BRAF V600E(VE1)抗体、OptiView DAB二抗试剂盒及OptiView AMP扩增试剂盒均购于罗氏公司。

1.3 方法

1.3.1生物信息学分析 从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)中选取数据集GSE3678(包括7例PTC和7例良性甲状腺组织)和GSE33630(包括49例PTC和46例良性甲状腺组织),分析SMOC2 mRNA在PTC和良性甲状腺组织中的表达量差异;从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库中提取505例甲状腺癌组织和59例良性甲状腺组织中SMOC2 mRNA的表达量,分析SMOC2 mRNA在两者中表达量差异。

1.3.2免疫组化 SMOC2、CK19、Galectin-3、MC采用免疫组化EnVision两步法染色,主要步骤:切片脱蜡水化,柠檬酸钠溶液热修复,过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min,滴加一抗4 ℃孵育过夜,二抗室温孵育20 min,DAB显色,苏木精复染,脱水、透明后光镜下观察。BRAF V600E通过BenchMark Ultra全自动免疫组化仪器进行染色,主要步骤:切片75 ℃预热4 min脱蜡水化,Ultra CC1碱性修复液100 ℃修复72 min,过氧化物酶抑制剂OV PEROX IHBTR孵育4 min,BRAF V600E一抗37 ℃孵育32 min;OV HQ UNIV LINKR孵育8 min;OV HRP MULTIMER孵育8 min;OV AMP H2O2和OV AMPLIFIER共同孵育4 min;OV AMP MULTIMER孵育4 min;OV H2O2和OV DAB共同孵育8 min;OV COPPER 孵育4 min;苏木精复染12 min,返蓝液孵育4 min,脱水、透明后光镜下观察。

1.4 结果判读SMOC2以上皮细胞胞质中出现黄色或褐色颗粒为阳性染色,CK19以上皮细胞胞质中出现黄色或褐色颗粒为阳性染色,Galectin-3以上皮细胞胞质和胞核中出现黄色或褐色颗粒为阳性染色,MC以上皮细胞腔缘顶端细胞膜出现黄色或褐色颗粒为阳性染色[6]。BRAF V600E以上皮细胞胞质中出现黄色或褐色颗粒为阳性染色[7]。SMOC2评分标准:按染色强度评分:阴性为0分,弱阳性为1分,中等强度阳性为2分,强阳性为3分。评分≥1分判为阳性[8]。CK19、Galectin-3、MC着色细胞占比>10%定义为阳性。BRAF V600E在细胞质中着色即为阳性,无着色为阴性。

1.5 统计学分析应用GraphPad Prism 6.0.1和SPSS 26.0软件进行统计学分析。采用χ2检验或Fisher精确检验分析组间蛋白表达差异及与临床病理特征的关系,采用传统诊断试验公式计算敏感度、特异性和诊断准确性,受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析诊断预测价值,采用Spearman等级相关检验分析相关性,结果均以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析SMOC2在PTC和良性甲状腺组织中的mRNA表达差异及诊断价值提取GEO数据库GSE3678和GSE33630两个数据集及TCGA数据库中甲状腺癌和良性甲状腺组织SMOC2 mRNA的表达量,对两者表达量进行差异性分析及ROC曲线分析,结果显示:SMOC2 mRNA在PTC中的表达量显著低于良性甲状腺组织(P<0.05,图1A～C),ROC曲线下面积(area under the curve, AUC)为0.910(P<0.001,图1D)。

图1 A.GEO数据库GSE3678数据集中甲状腺乳头状癌和良性甲状腺组织中SMOC2 mRNA的表达;B.GSE33630数据集中甲状腺乳头状癌和良性甲状腺组织中SMOC2 mRNA的表达;C.TCGA数据库中甲状腺癌和良性甲状腺组织中SMOC2 mRNA的表达;D.GEO数据库预测SMOC2对甲状腺乳头状癌诊断价值的ROC曲线

2.2 PTC和PTH中SMOC2蛋白表达及与临床病理特征的关系在PTH中,SMOC2蛋白表达于乳头状增生的上皮细胞中,定位于靠近腔缘顶端的细胞质,具有极性,呈非连续的线状颗粒性,阳性率为91.1%(41/45);在PTC中,SMOC2在癌组织中呈阴性或弱阳性弥漫分布,阳性染色满布于癌细胞胞质,阳性率为10.7%(8/75),明显低于PTH(P<0.001,图2)。SMOC2表达与淋巴结转移呈负相关(P<0.05),与患者性别、年龄、肿瘤最大径、是否甲状腺外浸润、TNM分期无相关性(P>0.05),且与BRAF V600E表达无相关性(rs=0.142,P>0.05,表1)。

表1 甲状腺乳头状癌中SMOC2表达与临床病理特征的关系

2.3 SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E对PTC的诊断价值及比较SMOC2对PTC诊断的敏感度为91.1%,特异性为89.3%,诊断准确性为90.0%,阳性似然比(positive likelihood ratio, PLR)为8.514,阴性似然比(negative likelihood ratio, NLR)为0.099。ROC曲线分析结果显示AUC值为0.898(P<0.001,图3)。在PTC组织中,CK19蛋白定位于细胞质,呈弥漫分布,诊断的敏感度为100.0%,特异性为84.4%;Galectin-3蛋白定位于细胞核和细胞质,呈弥漫分布,诊断的敏感度为92.0%,特异性为80.0%;MC蛋白定位于腔缘顶端细胞膜,呈完整连续着色,诊断的敏感度为94.7%,特异性为64.4%;BRAF V600E蛋白定位于细胞质,呈弥漫分布,诊断的敏感度为94.7%,特异性为88.9%。在PTH组织中,CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E均呈阴性(表2,图4)。单独诊断时,CK19的敏感度最高,但其特异性差;SMOC2诊断的敏感度虽然低于CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E,但特异性最高(89.3%)。

图3 SMOC2对甲状腺乳头状癌诊断价值的ROC曲线

图4 PTC和PTH的HE染色及CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E免疫组化染色,EnVision两步法:PTC.甲状腺乳头状癌;PTH.甲状腺乳头状增生

2.4 SMOC2联合CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E在PTC和PTH鉴别诊断中的价值在鉴别PTC和PTH时,SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E的诊断价值以敏感度和特异性的形式表现。SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E相互组合进行PTC联合辅助诊断(图5),SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E五者联合辅助诊断的AUC值为1.000(P<0.001),在一定程度优于其他标志物组合,当Cut-off值为0.500时,诊断的敏感度和特异性均高达100.0%。

图5 SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E联合辅助诊断的ROC曲线

3 讨论

SMOC2作为一种分泌型基质细胞蛋白,在许多组织中广泛表达,参与多种细胞功能,包括细胞黏附和迁移[9]、血管生成[10]、纤维增生[11]和细胞增殖[12]等,在多种实体肿瘤中起促癌或抑癌基因的作用。既往研究显示,其生物学功能主要多与促癌特性有关,但在结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌和晚期乳腺癌中起抑癌基因的作用[13],而在PTC中SMOC2蛋白表达情况及作用机制尚不明确。

本研究采用生物信息技术学在数据库中提取SMOC2 mRNA的表达量,分析其在PTC和良性甲状腺组织中的差异量表达,并在生信分析基础上对PTC和PTH石蜡切片进行SMOC2免疫组化检测。生物信息技术学结果显示SMOC2在PTC中的表达较良性甲状腺组织显著降低;免疫组化结果显示SMOC2在PTC组织中呈阴性或弱阳性弥漫着色,在PTH组织增生的乳头状结构中可见明显的阳性染色,呈线状颗粒性表达,其分布具有极性。可见,SMOC2在PTC组织中的阳性率降低和在细胞质中表达的极性消失可在一定程度上提示其恶性特征,对PTC诊断和鉴别诊断具有重要的辅助作用。

Jang等[14]的研究显示,SMOC2在正常结肠黏膜基底隐窝中呈阳性,在结肠癌组织中呈阴性或弱阳性弥漫表达,定位于细胞质,阳性率明显下降,在淋巴结转移病例中SMOC2表达进一步下降,且与淋巴结转移呈负相关。本组SMOC2在PTC中的表达情况在一定程度上与SMOC2在结肠癌中的表达及与临床病理特征的关系一致,但其是否在PTC中发挥抑癌基因的作用有待进一步研究。

分析SMOC2与PTC临床病理特征关系发现,SOMC2表达与淋巴结转移呈负相关,与患者性别、年龄、肿瘤最大径、是否甲状腺外浸润、TNM分期无相关性。既往研究[8]显示,在38%的PTC中观察到SMOC2完全缺失与BRAF突变缺失相关,本组PTC中SMOC2表达与BRAF V600E突变相关性分析并未发现两者间的相关性,有待扩大样本进一步观察。本组67例SMOC2表达丢失病例中,38例有淋巴结转移,29例无淋巴结转移,提示SMOC2丢失可能与PTC发生淋巴结转移相关。

根据Xin等[15]提出的标准,分子标志物的PLR>10或NLR<0.1可视为独立诊断指标,SMOC2的NLR<0.1,由此提示SMOC2可作为单独诊断PTC的标志物,但其缺乏较高敏感度和特异性,需与其他标志物联合检测。本实验CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E免疫组化结果与Asghari等[16]和Parker等[17]的研究结果一致。以上标志物相互组合,以SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E五者联合辅助诊断PTC时,其AUC值最高,辅助诊断效能优于其余标志物组合,成为新的高敏感度和特异性的组合。

综上所述,SMOC2阳性率下降和在细胞质中表达的极性消失可作为PTC诊断和鉴别诊断的重要标志物,与CK19、Galectin-3、MC、BRAF V600E五者联合检测优于其他标志物组合,可在一定程度上提高对PTC诊断的敏感度和特异性。