任文浩,黄小征,周立新,白艳花

WHO(2017版)甲状腺肿瘤分类中,甲状腺原发鳞状细胞癌被命名为仅显示鳞状分化的癌,不可伴有其他腺癌成分[1]。WHO(2022版)分类中,甲状腺原发鳞状细胞癌被划分为甲状腺未分化癌(鳞状细胞癌亚型),可以并存分化型甲状腺癌及低分化甲状腺癌成分[2-4]。鳞状细胞癌诊断标准的改变,导致后续临床治疗方案的选择发生了巨大变化。文献报道,15%～45%的甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)中可以出现鳞状细胞成分[5-6],鳞状细胞成分是否诊断为未分化癌(鳞状细胞癌亚型)对后续肿瘤的治疗和预后判断至关重要。目前,针对PTC中鳞状细胞成分是诊断为鳞状分化还是未分化癌,尚无明确的诊断标准。本研究拟探索PTC中鳞状细胞成分的组织学特点和免疫表型,建立鳞状细胞成分的分类诊断标准,将鳞状细胞成分分类为鳞状分化及未分化癌,研究两分类对预后的影响,并分析BRAF V600E和PD-L1(22C3)在鳞状细胞成分中的表达情况,为后续临床治疗提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2015～2023年北京大学肿瘤医院手术切除的PTC伴鳞状分化或PTC伴未分化癌,鳞状细胞癌亚型病例。纳入标准:PTC中含有鳞状细胞成分,无论鳞状细胞成分含量多少及异型程度。排除标准包括:有其他恶性肿瘤病史;肿瘤中存在除PTC及鳞状细胞成分的其他肿瘤成分。所有病例均经两位高年资病理医师复阅切片。合计纳入23例,其中初次手术20例,复发病例二次或多次手术3例。女性15例,男性8例。患者年龄19～75岁,中位年龄38岁。肿瘤最大径0.6～8.0 cm,中位最大径1.9 cm。随访时间6.0～98.5个月,中位随访时间28.8个月,3例复发,2例因癌死亡。

1.2 免疫组化p40(GR006,基因科技公司)、CK5/6(OTI1F8,北京中杉金桥公司)、Ki-67(MIB1,北京中杉金桥公司)、BRAF V600E(VE1,罗氏公司)、p53(DO-7,基因科技公司)、PD-L1(22C3,DAKO公司)、PAX8(OTI6H8,北京中杉金桥公司)、CD10(56C6,DAKO公司)染色均在免疫组化自动染色仪上实施,具体操作步骤严格参照试剂盒说明书进行。Ki-67增殖指数通过计数肿瘤内鳞状细胞成分表达热点区500个细胞中的表达情况进行评价,记为百分比;不足500个细胞的按实际情况全部计算;Ki-67不足1%的记为1%。BRAF V600E阳性判断标准为肿瘤细胞胞质内出现弥漫性着色[7-8]。PD-L1(22C3)染色判读采用综合阳性评分(combined positive score, CPS),CPS≥1定义为阳性[9-10]。p53蛋白表达判读分为高表达及非高表达,高表达的判读参考Deeken-Draisey等[11]的标准,定义为50%以上肿瘤细胞呈弥漫强阳性核着色。

1.3 统计学分析分类资料的假设检验采用Fisher精确概率法或似然比法;计数资料的假设检验采用Mann-WhitneyU检验。对于生存分析,分别以疾病进展及因癌死亡为结局变量,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,并采用Log-rank检验。采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,全部假设检验显著性水平α双侧=0.05。

2 结果

2.1 鳞状细胞成分的组织学特征PTC中的鳞状细胞呈现为两种分布形式:(1)散在的鳞状细胞团(10例),大部分为同心圆状鳞状小体(图1A),鳞状细胞异型性不明显,未见明确核分裂象。此种形态是鳞状分化最常见的表现形式。(2)弥漫成片分布(13例)(图1B、C),夹杂PTC或未夹杂PTC成分,不同病例细胞异型性轻-重度不等,部分可见细胞内角化及角化珠。鳞状细胞成分最大径0.4～5 cm。此种表现形式的鳞状细胞成分需进行鉴别诊断,以明确鳞状细胞成分是否为未分化癌。本组中,最大径0.4～1.3 cm的鳞状细胞成分细胞异型性不明显或轻度异型;最大径1.8～5.0 cm的鳞状细胞成分细胞中-重度异型,核分裂象易见。

2.2 免疫表型所有病例鳞状细胞成分p40(图1D)、CK5/6(图1E)均呈阳性。PAX8(图1F)在所有PTC中呈强阳性,在鳞状细胞成分中呈局灶弱阳性至弥漫强阳性不等。Ki-67在散在鳞状细胞团或最大径<1.5 cm的鳞状细胞成分中低表达,增殖指数1%～8%(图1G),在最大径>1.5 cm、细胞中-重度异型的鳞状细胞成分中高表达,均≥30%(图1H)。鳞状细胞成分与其背景中的PTC成分BRAF V600E表达情况一致,均为阳性或阴性。检测病例BRAF V600E阳性占47.8%,其中细胞中重度异型的鳞状细胞成分均呈阳性。p53高表达见于3例细胞呈中-重度异型的鳞状细胞成分(图1I),其余鳞状细胞成分及所有PTC成分均呈非高表达(图1J)。CD10在鳞状细胞成分中呈现强弱不等、阳性比例不等的胞质及胞膜着色,在中-重度异型的鳞状细胞成分中,有2/4例呈胞膜及胞质弥漫强阳性着色,而在其余病例中有3/19例呈弥漫强阳性着色(图1K)。PD-L1(22C3)CPS评分0～60不等,其中在中-重度异型的鳞状细胞成分中均呈阳性(图1L)。

2.3 鳞状细胞成分的分类及诊断标准根据鳞状细胞成分的分布状态、细胞的异型性及Ki-67增殖指数,可将鳞状细胞成分划分为两类:鳞状分化(19例)和未分化癌(4例)。前者表现为散在鳞状细胞团或成片分布,细胞异型性不明显,Ki-67增殖指数<10%;后者弥漫片状分布,细胞中-重度异型,Ki-67增殖指数≥30%。鳞状分化成片分布时,鳞状细胞成分最大径一般较小,≤1.5 cm,而未分化癌鳞状细胞成分最大径较大,均>1.5 cm。p53高表达对两者的鉴别具有重要价值,高表达仅见于未分化癌。Ki-67增殖指数与鳞状细胞的异型程度相一致,对于鳞状细胞成分的分类至关重要(图2A)。

图2 A.鳞状细胞成分分组与Ki-67增殖指数的关系,Mann-Whitney U检验,P<0.001;B.鳞状细胞成分分组与PD-L1(22C3)的关系,Mann-Whitney U检验,P=0.016;*代表极端值,鳞状分化病例中有1例CPS=60,由于背景中大量淋巴细胞着色所致

2.4 鳞状细胞成分分类与临床病理特征的关系鳞状细胞成分分类具有显著的临床病理相关性,其中,未分化癌与患者年龄>55岁、肿瘤最大径>2 cm、甲状腺外侵犯、鳞状细胞成分最大径>1.5 cm、高细胞亚型及经典型、高pT分期、p53高表达、BRAF V600E阳性均有相关性(表1)。BRAF V600E阳性见于所有未分化癌病例。两分类中PD-L1(22C3)表达差异具有统计学意义,未分化癌中PD-L1(22C3)均阳性且CPS评分更高(图2B)。BRAF V600E及PD-L1(22C3)阳性提示对未分化癌进行后续靶向治疗及免疫治疗的可行性。

表1 甲状腺乳头状癌中不同鳞状细胞成分与临床病理特征的关系

2.5 鳞状细胞成分分类对预后的影响无论是疾病无进展生存还是总生存,未分化癌病例预后均显著差于鳞状分化病例(图3)。19例鳞状分化病例中仅1例出现了疾病进展,为二次手术病例,均未出现因癌死亡。由此可见,鳞状分化对预后的影响不明显。未分化癌病例中,2例因癌死亡,为二次或多次手术病例,术后分别随访7、15个月。另2例未分化癌患者分别随访6、15.5个月,均未出现肿瘤复发。

图3 A.Kaplan-Meier生存曲线分析鳞状分化和未分化癌与疾病无进展生存的关系;B. Kaplan-Meier生存曲线分析鳞状分化和未分化癌与患者总生存的关系

3 讨论

PTC中鳞状细胞成分的诊断既往尚无明确的诊断标准。本研究汇总了单中心8年间的病例,对鳞状细胞成分的组织学特征进行了详尽分析,发现鳞状细胞成分可分为散在鳞状小体及弥漫成片两种分布方式,结合细胞异型性及Ki-67增殖指数可划分为鳞状分化及未分化癌两大类,前者包括所有的鳞状小体及部分成片分布的病例,细胞异型性不明显或轻度,而后者全部弥漫成片分布,细胞中-重度异型且鳞状细胞成分最大径均>1.5 cm。本组病例中,未分化癌的Ki-67增殖指数均≥30%,此与WHO中未分化癌(非鳞状细胞癌亚型)的Ki-67增殖指数一致;鳞状分化的Ki-67增殖指数均<10%。对于是否存在Ki-67增殖指数为10%～30%、鳞状分化与未分化癌鉴别困难的病例,因本组病例数有限,目前无法判断是否存在此类病例,需收集更多病例进一步积累经验及完善分类。有研究报道CD10在甲状腺未分化癌中呈强阳性,而在PTC及鳞状分化成分中呈阴性或弱阳性[12-13]。本组病例中,虽然未分化癌成分显示了更高比例的CD10强阳性着色,但鳞状分化成分中也有一定比例的强阳性着色,所以CD10染色并不能很好的鉴别鳞状分化和未分化癌。本组中疾病无进展生存和总生存分析均显示PTC中鳞状分化并未影响患者生存,而4例未分化癌,鳞状细胞癌亚型中有2例因癌死亡,预后与既往分类的未分化癌预后相当,在一定程度上证实了将鳞状细胞癌纳入未分化癌分类的合理性。

PTC中的鳞状细胞成分与PTC成分的BRAF V600E状态一致,且均呈PAX8阳性,提示两者组织学来源一致,均为滤泡上皮来源。在未分化癌成分中出现了PTC中不存在的p53蛋白高表达,提示未分化癌是由PTC出现累加TP53基因突变,进一步高级别转化而来。WHO(2022版)将甲状腺鳞状细胞癌纳入未分化癌的分类中,导致这类肿瘤后续临床治疗方案和管理的更新。BRAF V600E高突变和PD-L1(22C3)阳性给这部分患者带来了包括针对BRAF V600E的靶向治疗及免疫治疗的可供选择治疗方案及可预期的生存期的延长。本组2例存活的未分化癌患者分别在术前或术后采用了BRAF V600E靶向治疗。既往1例术前采用靶向治疗联合免疫治疗的未分化癌病例术后病理评估为完全缓解[14],术后至今随访2年,未见复发,提示靶向治疗联合免疫治疗未分化癌的有效性。

综上,本研究总结了PTC中鳞状细胞成分的组织学特点及免疫表型,将鳞状细胞成分划分为鳞状分化和未分化癌两大类,并提出了诊断标准。未分化癌中,鳞状细胞成分均弥漫成片分布,细胞中-重度异型,Ki-67增殖指数≥30%。鳞状分化和未分化癌具有鲜明的预后差异。未分化癌中BRAF V600E及PD-L1(22C3)阳性为这部分患者带来了相应的靶向治疗及免疫治疗的曙光。