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活血生肌方外用对大鼠压力性损伤组织金属蛋白酶-9及其抑制因子-1 表达的影响

2023-01-30苏玉娟潘孙峰胡衍泽单云岗于恩光

浙江中西医结合杂志 2023年1期
关键词:凡士林纱条生肌

苏玉娟 潘孙峰 熊 烈 胡衍泽 单云岗 于恩光

压力性损伤,俗称压疮,是由于皮下组织受长时间的压力作用导致组织缺血缺氧的结果,若创面累及深部皮下组织、肌肉及骨骼,可导致严重感染甚至死亡[1]。压疮是常见的难愈性溃疡之一,属中医“疮疡”范畴,历代医家多主张“祛腐”“活血”“生肌”等法来进行治疗。本研究旨在通过检测压力性损伤组织中金属蛋白酶-9(MMP-9)及组织抑制因子-1(TIMP-1)表达水平及Ⅰ型胶原表达量的变化,了解MMP-9 及TIMP-1 与压力性损伤创面病理变化的关系,进而探讨活血生肌方对压力性损伤的治疗机制。

1 实验材料

1.1 动 物 60 只SPF 级成年雄性SD 大鼠,体质量180~200 g,购买于浙江维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(浙)2019-0001,委托饲养于本院附属某医学院动物实验中心。通风环境,室温(25±2)℃,湿度(55±5)%。实验人员均持有动物实验许可证,动物福利完全按照国际相关实验动物法规实施。本研究通过浙江省嘉兴市中医医院伦理委员会审核,伦理批件号:2019KY0454。

1.2 药 物 黄凡士林(性状:膏剂,规格:500 g/罐,由南昌白云药企有限公司生产,生产批号20211002)。活血生肌方(由当归、丹参、红花、黄芪、乳香、没药、白芨、白芷、重楼、甘草组成)(配置比例为2∶2∶1∶1.5∶1∶1∶1∶1∶1∶1),粉碎过40 目。药粉与黄凡士林1∶3 配比,加热混合制成膏剂,均匀涂抹于纱条上制成膏剂厚度为2 mm 活血生肌纱条,同时制作厚度为2 mm 凡士林纱条。以上均由浙江省嘉兴市中医医院药剂科提供并制备。

1.3 试剂与仪器 MMP-9、TIMP-1 二抗DAB 免疫组化试剂盒(批号PV8000D,北京中杉有限公司),一抗ABD-0030 稀释液(批号211216S963c,福州迈新生物科技开发有限公司)。荧光正置显微镜(Zeiss,Axio Scope A1),凝胶成像仪(Tanon 5200 Multi)、蛋白质电泳系统(Bio.Rad),组织均质器(宁波新芝,Scientz-48)。

2 实验方法

2.1 造 模 大鼠实验前适应性喂养1 周,应用缺血-再灌注磁片循环压迫的方式,在大鼠背部建立上下两个压疮模型,通过皮层切口分离肌层,将无菌铁片植入皮下。大鼠如无感染现象,进行磁铁施压。施压24 h 后,使用无菌刀片划破受压皮肤至真皮层,继续施压24 h。见图1。

图1 大鼠背部建立压疮模型示意图

2.2 分组与给药 将造模成功的60 只压疮模型大鼠背部创面编号,按随机数表法分为治疗组和对照组,每组30 只,治疗组大鼠创面常规处理,予活血生肌纱条外敷后用无菌纱布覆盖,1 次/d,直至实验结束。对照组大鼠创面常规处理,予凡士林纱条外敷后用灭菌纱布覆盖,1 次/d,直至实验结束。

2.3 观察指标

2.3.1 压疮组织MMP-9 及其TIMP-1 表达 分别在换药第1、3、5、7、9 天各组随机抽取6 只压疮模型大鼠(12 个创面)用腹腔注射100 g/L 水合氯醛(300 mg/kg)的方法麻醉后切取背部创面中心部位处大小为0.3 cm×0.3 cm 的全层皮肤组织。取材后,予大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g 处死。根据所购试剂盒步骤,采用免疫组化法及Image J 图像软件分析测定创面组织中MMP-9 及其TIMP-1 蛋白表达量。

2.3.2 压疮组织Ⅰ型胶原蛋白及胶原纤维表达 取各组大鼠创面组织切片,常规脱蜡脱水,Masson 染色,组织胶原纤维呈蓝色。显微镜下观察胶原纤维表达情况。采用Image J 图像分析软件分析每平方毫米组织中的Ⅰ型胶原及胶原纤维表达量。

2.4 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件,正态分布计量资料以均数±标准差()表示,组间比较采用单因素方差分析;非正态分布计量资料以中位数(P25-P75)表示,组间比较采用Wilcoxon 秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 两组大鼠疮面组织MMP-9 表达量比较 换药第1 天,两组大鼠创面组织MMP-9 表达差异无统计学意义(P>0.05);换药第3 天开始,治疗组大鼠创面组织MMP-9 表达量较对照组降低(P 均<0.01),见表1、图2。

图2 免疫组化法检测不同方法处理大鼠背部压力性损伤组织MMP-9(棕黄色)表达(二氨基联苯胺-苏木素染色,×100)注:a、b、c、d 分别为凡士林纱布换药第3、5、7、9 天创面组织MMP-9 镜下表达情况;A、B、C、D 分别为活血生肌方纱条换药第3、5、7、9 天创面组织MMP-9 镜下表达情况;MMP-9 为金属蛋白酶-9

表1 两组大鼠创面组织各时间点MMP-9 表达量比较()

表1 两组大鼠创面组织各时间点MMP-9 表达量比较()

注:治疗组常规创面处理基础上给予活血生肌纱条换药;对照组常规创面处理基础上给予凡士林纱条外敷;MMP-9 为金属蛋白酶-9;与对照组比较,aP<0.01

3.2 两组大鼠疮面组织TIMP-1 表达量比较 换药第1 天,两组大鼠创面组织TIMP-1 表达差异无统计学意义(P>0.05);换药第3 天开始,治疗组大鼠创面组织TIMP-1 含量较对照组升高明显(P 均<0.05),见表2、图3。

图3 免疫组化法检测不同方法处理大鼠背部压力性损伤组织TIMP-1(棕黄色)表达(二氨基联苯胺-苏木素染色,×100)注:a、b、c、d 分别为凡士林纱布换药第3、5、7、9 天创面组织TIMP-1 镜下表达情况;A、B、C、D 分别为活血生肌方纱条换药第3、5、7、9 天创面组织TIMP-1 镜下表达情况;TIMP-1 为组织抑制因子-1

表2 两组大鼠创面各时间点TIMP-1 含量比较()

表2 两组大鼠创面各时间点TIMP-1 含量比较()

注:治疗组常规创面处理基础上给予活血生肌纱条换药;对照组常规创面处理基础上给予凡士林纱条外敷;TIMP-1 为组织抑制因子-1;与对照组比较,aP<0.05

3.3 两组大鼠疮面组织Ⅰ型胶原蛋白表达量比较换药第1 天,两组大鼠创面组织Ⅰ型胶原蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);换药第3 天,两组大鼠创面组织均可见Ⅰ型胶原蛋白的形成,治疗组高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05);换药第5、7、9 天,治疗组Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显增多(P 均<0.05),胶原蛋白结构致密,成熟度较高。见表3、图4。

表3 两组大鼠创面组织各时间点Ⅰ型胶原蛋白表达量比较()

注:治疗组常规创面处理基础上给予活血生肌纱条换药;对照组常规创面处理基础上给予凡士林纱条外敷;与对照组比较,aP<0.05

图4 不同方法处理大鼠背部压力性损伤组织中Ⅰ型胶原(蓝色)表达(Masson 染色,×100)

3.4 两组大鼠疮面组织胶原纤维表达量比较 两组大鼠在换药前压疮皮肤组织胶原纤维排列紊乱,表达量少,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,治疗组胶原纤维表达量从第3 天开始增多,但差异无统计学意义(P>0.05);第5、7、9 天,治疗组胶原纤维表达量较对照组明显增多(P 均<0.05),含量丰富,排列有序。见表4、图5。

图5 不同方法处理大鼠背部压力性损伤组织中胶原纤维(蓝色)表达(Masson 染色,×100)

表4 两组大鼠创面组织各时间点胶原纤维表达量比较()

表4 两组大鼠创面组织各时间点胶原纤维表达量比较()

注:治疗组常规创面处理基础上给予活血生肌纱条换药;对照组常规创面处理基础上给予凡士林纱条外敷;与对照组比较,aP<0.05

4 讨论

在压疮愈合进程中,以胶原纤维为主要成分的细胞外基质(ECM)的过度降解是创面难愈的重要因素。而MMP-9 是参与ECM 降解的蛋白酶,其过度表达可影响胶原沉积过程,导致组织液化,其活性受金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)的影响。研究表明,MMP-9 参与压疮[2-3]病理过程,其在创面组织表达增高是溃疡愈合不良的预测因素;慢性创面TIMP-1 缺如或显著低于正常愈合伤口,且MMP/TIMP 比例的失衡可能与伤口愈合延迟有关[4]。以上均提示MMP-9 不利于创面愈合,而TIMP-1 上调可能中和过强MMP-9的活性,因此MMP-9、TIMP-1 的表达失调与创面不愈合密切相关。

压疮为临床典型的慢性皮肤溃疡。课题组根据压疮的病因病机,采用活血生肌方治疗12 年,应用活血生肌中药灌洗联合封闭式负压引流治疗压疮等难治性创面[5-6],疗效显著。其中黄芪具有益气升阳、托毒生肌之效,方中重用为君药;当归、丹参化瘀通络,白芷辛温通窍、溃脓止痛,白及活血生肌,共为臣药;辅以红花、乳香、没药为佐药,增活血化瘀之功;甘草调和诸药,滋润肌肤,诸药合用,共奏活血行气、化瘀生肌之效。研究表明,活血生肌方的方药组份黄芪、当归、丹参等具有调节MMP-9、TIMP-1 表达,促进血管新生作用[7-8]。本实验结果显示,治疗组在使用活血生肌方外用3 d 后,压疮组织中MMP-9 含量明显降低,同时TIMP-1 的含量提高;使用活血生肌方外用5 d 后,胶原蛋白及胶原纤维的表达也均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述,活血生肌方对压力性损伤的良性影响,可能是通过调节创面MMP-9 及TIMP-1 表达水平,以减少胶原蛋白的降解,进而促进压疮组织的愈合。但肉芽组织由细胞及细胞外基质组成,此实验只表明其能阻止ECM 过度降解,但活血生肌方能否促进组织中细胞生长还有待于进一步深入研究。

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