陈 健 潘 达 金 灿 闻 浩 孟伟阳 叶孙志

创伤性脑损伤（TBI）是人类死亡和致残的主要原因之一。脑损伤可分为原发性和继发性两个阶段，原发性损伤是脑组织的机械性破坏，而继发性损伤则在较长时间内发展，包括氧化应激和炎症反应，最终导致神经元细胞死亡[1]。目前临床上对TBI 主要通过补液、降低颅内压、开颅手术等方式进行治疗[2]。但是TBI 发生后所引起的一系列炎症反应在疾病的继发性损伤中起到了重要作用，因此找到其作用机制，对于TBI 后继发损伤发生的预防具有重要意义。蛋白激酶B（Akt）活化通路已被证明是治疗TBI 的有效策略[3]，核因子E2 相关因子2（Nrf2）是碱性亮氨酸拉链转录因子家族的成员之一，可调节细胞保护因子以应对氧化应激[4]。研究显示，激活Akt/Nrf2 信号通路对TBI 小鼠神经元损伤具有保护作用[5]。黄芩苷是一种主要来源于高黄芩、黄芩和半枝莲等草本植物的化学物质，具有抗炎、抗肿瘤等药理作用[6]。基于此，本研究通过建立TBI 模型大鼠，研究黄芩苷对TBI 模型大鼠以及Akt/Nrf2 信号通路的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级12 周龄SD 大鼠，79 只，体质量（200～220）g，雌雄各半，购自重庆医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（渝）2019-0017，所有大鼠均饲养于清洁级动物房内（温度：18～25 ℃，相对湿度：60%～70%），自由取食、饮水，自动控制光照/黑暗交替（12 h/12 h）。本研究已获得医院伦理委员会审核，批件编号：2021 伦审第017 号。

1.2 主要药物、试剂和仪器 黄芩苷（原料药，纯度99.95%，批号24015-13-6）购自南京源植生物科技有限公司；单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液（规格2 mL∶20 mg，批号20200713）购自长春翔通药业有限公司；苏木素-伊红（HE）染液（批号HA5047）、PCR 试剂盒（批号HA1572）、蛋白提取试剂盒（批号HA0155L）、Akt（批 号 HA3027R）、Nrf2（批 号HA3014R）、β-肌动蛋白（β-actin）（批号HA1058R）单克隆抗体、兔抗鼠二抗（批号HA1156R）均购自杭州华安生物技术有限公司；烤箱（型号WTOJM102X）购自美国惠而浦公司；脑创伤打击器（型号ZH-ZYQ）、显微镜（型号CMY-280）、荧光定量PCR仪（型号MA-8000）、凝胶成像系统（型号1880）均购自广东谨诺科技有限公司。

1.3 动物建模、分组及给药 参照文献[7]的方法进行TBI 造模，将大鼠采用乙醚麻醉后固定于脑创伤打击器上，沿头皮正中切开，在右侧颅骨制作一个直径5 mm 的骨窗，保持硬脑膜完整，采用脑创伤打击器将25 g 的砝码从40 cm 高度处自由落下，撞击右侧颅骨骨窗的硬脑膜，然后止血缝合头皮，大鼠苏醒后出现四肢运动不协调、短暂呼吸抑制，表明TBI 造模成功（若大鼠失血过多或者3 h 内死亡，视为造模失败）。共67 只大鼠参与造模，7 只造模失败，成功造模60 只大鼠，按随机数字表法分成模型组、阳性对照组及黄芩苷低、中、高剂量组，每组12 只。另取12只大鼠只制作骨窗，不进行撞击，设为假手术组。造模后3 h，阳性对照组大鼠肌肉注射14 mg/kg 单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液（用生理盐水将单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液溶解成浓度为1.4 mg/mL 的溶液，注射体积10 mL/kg）[7]；黄芩苷低、中、高剂量组大鼠分别灌胃50、100、200 mg/kg 的黄芩苷（用生理盐水将黄芩苷溶解成浓度分别为5、10、20 mg/mL 的混悬液，灌胃体积10 mL/kg）[8]；模型组和假手术组大鼠灌胃10 mL/kg 的生理盐水；每天给药1次，连续给药7 d。给药期间，模型组大鼠死亡2 只，其余各组大鼠均存活。

1.4 大鼠神经功能缺损评分测定 分别于造模后3 h和末次给药后2 h，采用改良神经功能缺损评分（mNSS）[9]评定大鼠神经功能受损情况，mNSS 评分包括四个方面：（1）运动试验、（2）感觉试验、（3）反射丧失和不正常运动、（4）癫病、肌阵挛、肌张力障碍，总分为18 分，得分越高表示神经功能损害越严重。

1.5 大鼠脑组织含水量检测 mNSS 评分测定完毕后，各组大鼠全部处死，模型组获取4 只大鼠完整脑组织，其余各组获取6 只大鼠完整脑组织，称量完整脑组织重量为湿重，然后将脑组织放在烤箱中（72 ℃，72 h）进行烘干，称其干重，计算脑组织含水量，脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.6 大鼠脑组织病理结构观察 取各组剩余6 只大鼠的损伤部位脑组织，分成三部分，一部分脑组织用生理盐水漂洗后置于甲醛中固定，制作HE 染色切片，观察各组大鼠脑组织病理结构。

1.7 大鼠脑组织Akt、Nrf2 mRNA 表达水平检测取1.6 中另一部分脑组织，制成匀浆，Trizol 法提取脑组织总RNA，逆转录合成cDNA，然后采用PCR 试剂盒进行反应，Akt、Nrf2 及内参β-actin 引物由武汉转导生物科技发展有限公司合成，序列如下：Akt 正向5'-GTAGATAAGGTAGTCCGACTCGTAG-3'，Akt 反向5'-ACGTTCCGGACGTGCCATTACGTCT-3'；Nrf2正向5'-CTGAATCGATCCTCGGACGA-3'，Nrf2 反向5'-AGTGAACGGTAGACCTGAAT-3'；β-actin 正 向5'-AGCCATGCCATGAATCACTA-3'，β-actin 反 向5'-CGACGTCACGAATCGAGCTC-3'。扩增条件为：92℃，6 min；38 个PCR 循环（97 ℃，12 s；58 ℃，15 s；62℃，15 s）。2-ΔΔCt法计算脑组织Akt、Nrf2 mRNA 表达水平。

1.8 大鼠脑组织Akt、Nrf2 蛋白表达水平检测 取1.6 中最后一部分脑组织，制成匀浆，采用蛋白提取试剂盒分离总蛋白，定量蛋白浓度后，上样20 μg 蛋白进行电泳，然后转膜，脱脂奶封闭2 h，加入Akt（1∶300）、Nrf2（1∶300）和β-actin（1∶500）单克隆抗体4 ℃孵育24 h，加入兔抗鼠二抗（1∶2000）孵育2 h，磷酸盐缓冲液洗膜，最后采用凝胶成像系统进行显影。

1.9 统计学方法 应用SPSS 25.0 统计软件处理数据，计量资料经检验均符合正态分布，采用均数±标准差（）描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠mNSS 评分比较 造模后3 h，与假手术组比较，其余各组大鼠mNSS 评分均升高（P均<0.05），但其余各组大鼠mNSS 评分之间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。末次给药后2 h，与假手术组比较，模型组大鼠mNSS 评分升高（P<0.05）；与模型组比较，阳性对照组及黄芩苷低、中、高剂量组大鼠mNSS 评分均降低（P 均<0.05），且黄芩苷各剂量组之间呈剂量依赖性（P 均<0.05）；阳性对照组和黄芩苷高剂量组大鼠mNSS 评分差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠mNSS 评分比较（分，）

表1 各组大鼠mNSS 评分比较（分，）

注：假手术组灌胃10 mL/kg 生理盐水；模型组灌胃10 mL/kg 生理盐水；阳性对照组肌肉注射14 mg/kg 单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液；黄芩苷低、中、高剂量组分别灌胃50、100、200 mg/kg 黄芩苷；mNSS 为改良神经功能缺损评分；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性对照组比较，cP＜0.05；与黄芩苷低剂量组比较，dP＜0.05；与黄芩苷中剂量组比较，eP＜0.05

2.2 各组大鼠脑组织含水量比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织含水量升高（P<0.05）；与模型组比较，阳性对照组及黄芩苷低、中、高剂量组大鼠脑组织含水量均降低（P 均<0.05），且黄芩苷各剂量组之间呈剂量依赖性（P<0.05）；阳性对照组和黄芩苷高剂量组大鼠脑组织含水量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠脑组织含水量比较（%，）

表2 各组大鼠脑组织含水量比较（%，）

注：假手术组灌胃10 mL/kg 生理盐水；模型组灌胃10 mL/kg 生理盐水；阳性对照组肌肉注射14 mg/kg 单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液；黄芩苷低、中、高剂量组分别灌胃50、100、200 mg/kg 的黄芩苷；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性对照组比较，cP＜0.05；与黄芩苷低剂量组比较，dP＜0.05；与黄芩苷中剂量组比较，eP＜0.05

2.3 各组大鼠脑组织病理结构观察 假手术组大鼠脑组织细胞结构完整、排列整齐，未见出血及水肿；模型组大鼠脑组织细胞排列松散，且部分细胞点状坏死，大量炎性细胞浸润，出血和水肿明显；黄芩苷低、中、高剂量组大鼠脑组织出血、水肿面积和点状坏死细胞数量逐渐减少；阳性对照组和黄芩苷高剂量组效果相近。见图1。

图1 各组大鼠脑组织病理结构图（HE 染色，×200）

2.4 各组大鼠脑组织Akt、Nrf2 mRNA 表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织Akt、Nrf2 mRNA 表达水平降低（P<0.05）；与模型组比较，阳性对照组及黄芩苷低、中、高剂量组大鼠脑组织Akt、Nrf2 mRNA 表达水平均升高（P 均<0.05），且黄芩苷各剂量组之间呈剂量依赖性（P<0.05）；阳性对照组和黄芩苷高剂量组大鼠脑组织Akt、Nrf2 mRNA 表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠脑组织Akt、Nrf2 mRNA 表达水平比较（）

表3 各组大鼠脑组织Akt、Nrf2 mRNA 表达水平比较（）

注：假手术组灌胃10 mL/kg 生理盐水；模型组灌胃10 mL/kg 生理盐水；阳性对照组肌肉注射14 mg/kg 单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液；黄芩苷低、中、高剂量组分别灌胃50、100、200 mg/kg 黄芩苷；Akt mRNA 为蛋白激酶B 信使核糖核酸；Nrf2 mRNA 为核因子E2 相关因子2 信使核糖核酸；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性对照组比较，cP＜0.05；与黄芩苷低剂量组比较，dP＜0.05；与黄芩苷中剂量组比较，eP＜0.05

2.5 各组大鼠脑组织Akt、Nrf2 蛋白表达水平比较与假手术组比较，模型组大鼠脑组织Akt、Nrf2 蛋白表达水平降低（P<0.05）；与模型组比较，阳性对照组及黄芩苷低、中、高剂量组大鼠脑组织Akt、Nrf2 蛋白表达水平均升高，且黄芩苷各剂量组之间呈剂量依赖性（P<0.05）；阳性对照组和黄芩苷高剂量组大鼠脑组织Akt、Nrf2 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4、图2。

图2 各组大鼠脑组织Akt、Nrf2 蛋白印迹图

表4 各组大鼠脑组织Akt、Nrf2 蛋白表达水平比较（）

表4 各组大鼠脑组织Akt、Nrf2 蛋白表达水平比较（）

注：假手术组灌胃10 mL/kg 生理盐水；模型组灌胃10 mL/kg 生理盐水；阳性对照组肌肉注射14 mg/kg 单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液；黄芩苷低、中、高剂量组分别灌胃50、100、200 mg/kg 黄芩苷；Akt 为蛋白激酶B；Nrf2 为核因子E2 相关因子2；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性对照组比较，cP＜0.05；与黄芩苷低剂量组比较，dP＜0.05；与黄芩苷中剂量组比较，eP＜0.05

3 讨论

黄芩苷是一种黄酮类化合物。研究显示，黄芩苷能够修复脱髓鞘疾病小鼠的中枢神经系统，从而改善小鼠的神经功能[10]。Zheng 等[11]研究发现，黄芩苷可改善蛛网膜下腔出血大鼠mNSS 评分和脑含水量，减轻大鼠脑水肿病变，发挥脑保护作用。而脑水肿会导致TBI 大鼠颅内压升高，是TBI 早期死亡的主要原因[12]。本研究发现，当构建TBI 模型后，会导致大鼠mNSS 评分升高，同时脑组织含水量显著上升，可能是由于TBI 后继发脑水肿，压迫中枢神经，导致大鼠神经功能受损。对TBI 模型大鼠采用黄芩苷进行干预治疗后，大鼠mNSS 评分和脑组织含水量降低，提示黄芩苷可能是通过减轻TBI 模型大鼠脑水肿状态，从而达到改善其神经功能的作用，这与Ai 等[10]、Zheng 等[11]研究结果一致。病理结果显示，TBI 发生后大鼠脑组织细胞排列松散，且部分细胞点状坏死，大量炎性细胞浸润，出血和水肿明显，提示TBI 后的炎症反应加重，造成继发性损伤。而黄芩苷可有效降低大鼠脑组织出血、水肿面积，同时降低炎性细胞数量，表明黄芩苷可能通过抑制炎症反应来缓解TBI后的继发性损伤，在TBI 发生的过程中起到保护作用。

Akt/Nrf2 通路是反映脑损伤的关键信号通路，Zhu 等[13]研究显示，银杏叶提取物能够激活Akt/Nrf2通路，发挥对脑缺血/再灌注损伤大鼠的神经保护作用。Luo 等[14]研究发现，激活Akt/Nrf2 信号通路可抑制缺氧缺血性脑损伤大鼠脑组织炎症，减少脑水肿和神经元凋亡，从而发挥神经保护作用。Gou 等[15]研究显示，褪黑素可通过激活Akt/Nrf2 途径，增强缺氧缺血性脑损伤大鼠学习和记忆能力，抑制神经元细胞焦亡，发挥脑保护作用。以上研究结果均表明，Akt/Nrf2 通路的激活水平可能与大鼠的神经功能存在密切相关性。本研究结果显示，TBI 的发生在分子机制方面会导致大鼠脑组织Akt、Nrf2 mRNA 和蛋白表达水平降低，而这也可能是导致炎症反应加剧的原因之一。黄芩苷治疗可提高大鼠脑组织Akt、Nrf2 mRNA 和蛋白表达水平，提示黄芩苷可激活Akt/Nrf2信号通路，而高表达的Akt、Nrf2 可有效抑制机体过强的炎症反应，从而发挥对TBI 大鼠的脑保护作用。

综上所述，黄芩苷可改善TBI 模型大鼠脑神经损伤和脑水肿，其机制可能与黄芩苷激活Akt/Nrf2信号通路，促进Akt、Nrf2 mRNA 和蛋白表达有关。