刘 峰 项 艳

眩晕是常见的临床症状，对于患者的身心健康具有潜在的危害[1-2]。循环缺血是引起眩晕的常见原因，被称之为缺血性眩晕。长期缺血性眩晕可导致脑部神经细胞受损，甚至器质性改变及持久性神经功能障碍[3-4]。因此，有效预防或治疗缺血性眩晕具有重要临床价值。黄芩素是一种黄酮类化合物，具有广泛的药理作用[5-6]。近年研究显示，黄芩素除在抗病毒、抗炎、抗癌等方面发挥积极作用外，还在脑缺血/再灌注损伤中起到保护作用[6]。脂质聚合物纳米粒（lipidpolymer hybrid nanoparticles，LPNs）是材料与制剂相结合的新型纳米递药系统。LPNs 具有控释、靶向递送以及降低药物毒副作用等优点[7]。近年来，多肽修饰的药物，如靶向肽、穿膜肽、序列肽等，逐渐被重视。研究显示，TAT 短肽修饰的药物易通过血脑屏障[8]。本研究通过构建TAT 短肽修饰的载黄芩素脂质聚合物纳米粒（TAT modified baicalein-loaded lipid polymer nanoparticles，Bai-TAT-LPNs），观察其对脑缺血性眩晕模型大鼠的作用，为临床提供基础理论依据。

1 实验材料

1.1 动 物 健康SPF 级雄性SD 大鼠80 只，由杭州子源实验动物科技有限公司提供，许可证号SCXK（浙）2019-0004。合格证号：No.20200809 Abzz01050 00595。大鼠饲养在清洁级动物房中，12h 照明/12 h黑暗，温度26～28 ℃，湿度40%～60%，自由饮水摄食。本实验经动物伦理委员会审核（批准文号：20200619）。

1.2 主要试剂 黄芩素（20 mg/支；批号20200725）购自成都德思特生物技术有限公司；TAT 穿膜肽购自上海强耀生物；合成磷脂（DSPE-mPEG2000）（批号N1416）购自西安瑞禧生物；脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗体（批号H1735）购自美国santa 公司；免疫组化试剂盒购自欣博盛生物。乳酸（lactic acid，LAC）、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒购自南京建成公司。

1.3 主要仪器 RE-2000B 旋转蒸发仪（郑州华辰）；H1850R 超速低温离心机（湖南湘仪）；小鼠跳台记录仪（上海艾研）；CX23 正置显微镜（日本奥林巴斯）；VMR 小动物麻醉机（美国Matrx）；透射电子显微镜（日本JEOL 公司）；BV-520T 激光多普勒血流仪（深圳贝斯曼精密仪器）；MR-96A 酶标仪（深圳迈瑞）；粒径分析仪（丹东百特仪器）。

2 实验方法

2.1 Bai-TAT-LPNs 的制备 Bai-TAT-LPNs 的制备采用纳米沉淀法。制备水相：制备100 mg/mL 的DSPE-mPEG2000 乙醇溶液500 μL，溶解于去离子水中。制备油相：10 mg Bai 和120 mg 聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于20 mL 乙腈中。将油相混入水相中，以旋转蒸发仪去除乙腈，0.8 μm 滤膜过滤即得LPNs。向LPNs 中加入1 mL TAT，4 ℃、100 r/min 孵育过夜，而后采用琼脂糖凝胶CL-4B 柱去除游离TAT，去离子水洗脱，所得液体即为Bai-TAT-LPNs。

2.2 动物实验分组、给药及跳台反射训练 实验动物以简单随机分组法分为假手术组、模型组、Bai 组、Bai-TAT-LPNs 组，模型大鼠构建方法见2.3。每组最终筛选8 只合格大鼠入组。Bai 组和Bai-TAT-LPNs组以腹腔注射给予Bai 当量为100 mg/kg，模型组给予等体积生理盐水进行对照。每天给药1 次，共给药5 d。跳台反射训练时间为每次给药后2 h。设置刺激电压和时长分别为32 V 和5 min。每次训练时大鼠应适应测试环境5 min。检测记录跳台潜伏期（step down latency，SDL）。

2.3 脑缺血眩晕模型大鼠构建 最后一次给药前，大鼠采用异氟烷麻醉。手术方法：钝性分离右侧颈总动脉和锁骨下动脉并穿线结扎，最终缝合皮肤。模型组、Bai 组和Bai-TAT-LPNs 组通过手术结扎颈总动脉和锁骨下动脉，假手术组只进行手术而不进行结扎处理。随后进行给药，给药后1 h 后采用离心机对大鼠进行眩晕处理，眩晕30 s 后用于后续实验。

2.4 各组大鼠前庭神经核组织血流量检测 以激光多普勒血流仪检测各组大鼠正常血流量曲线，而后将备用线结扎血管（除假手术组），记录第5～30 min血流量值，计算前庭神核组织血流量降率。

2.5 各组大鼠LAC、LDH、SOD 及MDA 检测 取各组大鼠右侧脑组织0.2 g，加入1.2 mL 生理盐水，放入研磨球后间歇性匀浆15 s，将匀浆液以3000 r/min离心5 min，吸取上清液转移至1.5 mL 离心管中，参照LAC、LDH、MDA、SOD 检测试剂盒说明书检测各指标水平。

2.6 各组大鼠脑组织BDNF 蛋白表达检测 解剖大鼠颅脑，分离大脑海马CA1 区组织，各组大鼠组织经固定、脱水、石蜡包埋后制成切片。切片经水化、去除内源性过氧化氢酶、封闭等步骤，后依次孵育脑源性神经生长因子（BDNF）抗体（1∶1000）、二抗、色源底物，脱水后以中性树脂进行封片，拍照记录组织BDNF 染色情况。通过Image-Pro Plus 6.0 软件测量组织切片的平均光密度（integrated optical density，IOD）值。

2.7 统计学方法 所有数据经正态性检验符合正态分布，以均数±标准差（）表示。统计数据软件为SPSS 14.0。多组间比较采用单因素方差分析，事后检验采用LSD-t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Bai-TAT-LPNs 的表征 Bai-TAT-LPNs 的平均粒径为（127±2.6）nm（见图1A）。Bai-TAT-LPNs 外观呈均一的球形（见图1B）。

3.2 各组大鼠SDL 比较 模型组大鼠SDL 较假手术组明显增加（P＜0.01）；Bai 或Bai-TAT-LPNs 治疗能有效缩短模型大鼠SDL（P＜0.01），且Bai-TAT-LPNs 治疗效果优于Bai（P＜0.01），见表1。

表1 各组大鼠SDL 比较（s，）

表1 各组大鼠SDL 比较（s，）

注：Bai 组和Bai-TAT-LPNs 组腹腔注射Bai 100 mg/kg；模型组给予等体积生理盐水；SDL 为跳台潜伏期；Bai 为黄芩素；Bai-TAT-LPNs为TAT 修饰的载黄芩素脂质聚合物纳米粒；与假手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与Bai 组比较，cP＜0.01

3.3 各组大鼠前庭神经核血流量比较 5～30 min 检测时间内，模型组较假手术组前庭神经核组织血流量显著下降（P 均＜0.01）；Bai 或Bai-TAT-LPNs 治疗均可一定程度升高模型大鼠前庭神经核组织血流量，且Bai-TAT-LPNs 效果优于Bai（P 均＜0.01），见表2。

表2 各组大鼠前庭神经核血流量比较（%，）

表2 各组大鼠前庭神经核血流量比较（%，）

注：Bai 组和Bai-TAT-LPNs 组腹腔注射Bai 100 mg/kg；模型组给予等体积生理盐水；Bai 为黄芩素；Bai-TAT-LPNs 为TAT 修饰的载黄芩素脂质聚合物纳米粒；与假手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与Bai 组比较，cP＜0.01

3.4 各组大鼠脑组织LAC、LDH、SOD 及MDA 比较与假手术组比较，脑缺血性眩晕模型大鼠LAC、MDA 及LDH 含量增加，SOD 含量下降（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，Bai-TAT-LPNs 组LAC、MDA及LDH 含量显著降低，SOD含量升高（P＜0.05 或P＜0.01）。Bai-TAT-LPNs 组LDH 和SOD 含量较Bai 组差异显著（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠LAC、LDH、SOD 及MDA 水平（）

表3 各组大鼠LAC、LDH、SOD 及MDA 水平（）

注：Bai 组和Bai-TAT-LPNs 组腹腔注射Bai 100 mg/kg，模型组给予等体积生理盐水；Bai 为黄芩素；Bai-TAT-LPNs 为TAT 修饰的载黄芩素脂质聚合物纳米粒；LAC 为乳酸；LDH 为乳酸脱氢酶、MDA 为丙二醛；SOD 为超氧化物歧化酶；与假手术组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01；与Bai 组比较，eP＜0.05

3.5 各组大鼠脑组织BDNF 蛋白表达比较 假手术组、模型组、Bai 组、Bai-TAT-LPNs 组BDNF 蛋白平均IOD 值分别为（3252.25±396.60）、（2889.58±525.6）、（6612.18±896.62）、（9256.66±958.68）。Bai 组和Bai-TAT-LPNs 组较模型组BDNF 蛋白平均IOD 值均显著升高（P＜0.01）；与Bai 组比较，Bai-TAT-LPNs 组BDNF 蛋白平均IOD 值明显升高（P＜0.01），见图2。

图2 各组大鼠脑组织BDNF 蛋白表达（免疫组织化学染色，200×）

4 讨论

本研究将TAT 修饰的LPNs 载药系统成功包载Bai 制备出Bai-TAT-LPNs。LPNs 载药系统在缓释药物、提高疗效和降低毒性方面具有明显优势[9]。而对纳米粒子表面进行功能性修饰，可进一步增强药物疗效，如TAT 修饰药物具有较强的细胞膜穿透能力，易通过血脑屏障[8，10-11]。提示，Bai-TAT-LPNs 可能具有更高的药效以及较低的毒性。

为了观察Bai-TAT-LPNs 对脑缺血性眩晕模型大鼠的作用，本研究通过手术结扎大鼠右侧颈总动脉和锁骨下动脉，并通过离心机眩晕处理构建缺血性眩晕大鼠模型。进一步实验发现模型大鼠的SDL增加，前庭核血流量降低。前庭是机体平衡的重要作用系统，其缺血会导致前庭功能紊乱而引起眩晕[12]。而SDL 是反映模型大鼠眩晕程度的重要行为学指标[12]。这些结果提示，缺血性眩晕大鼠模型构建成功。通过Bai-TAT-LPNs 治疗模型大鼠发现，Bai-TAT-LPNs 能明显缩短SDL，增加前庭血流量，且效果优于Bai。表明，TAT-LPNs 增强了Bai 对脑缺血性眩晕模型大鼠的疗效。通常情况下，脑缺血缺氧可引起大量的过氧化物产生，并且机体不易将过氧化产物清除[13]。过多的过氧化产物导致细胞膜脂质过氧化，细胞通透性增加，最终引起氧化损伤[14]。文献显示，缺血性眩晕模型大鼠脑组织过氧化产物（LDH、LAC 和MDA）和氧自由基清除物（SOD）异常[3，12]。本研究观察发现，缺血性眩晕模型大鼠脑组织LDH、LAC 和MDA 含量增加，而SOD 含量降低。Bai 和Bai-TAT-LPNs 均可逆转LAC、MDA、LDH 和SOD 变化，且Bai-TAT-LPNs 作用更为明显。提示TAT-LPNs 增强了Bai 对缺血性眩晕模型大鼠脑部氧化损伤的保护作用。

脑衍生神经营养因子BDNF 广泛存在于机体的组织细胞中，它通过与酪氨酸激酶B 结合而发挥作用[15]。研究已证实，大脑海马组织BDNF 表达与大鼠学习记忆相关[15]。而在本研究中，缺血性眩晕模型大鼠大脑海马C1 区组织BDNF 弱表达，而Bai 和Bai-TAT-LPNs 治疗后分别表达升高，尤其Bai-TAT-LPNs 组。提示Bai 和Bai-TAT-LPNs 可能通过上调BDNF 表达而增强大鼠学习和记忆能力，而该作用可能与改善SDL 变化有关。

总之，Bai-TAT-LPNs 对脑缺血性眩晕模型大鼠具有较好的预防或治疗作用，该作用可能与增加前庭核血流量、降低氧化损伤及上调脑海马组织BDNF蛋白表达有关。