林 朔，李京向，陈宝元

(1.临沂大学实验中心，山东临沂 276000;2.北京中医药大学东直门医院肛肠科，北京 100700; 3.天津中医药大学第二附属医院中医外科，天津 300150)

象皮对体外培养成纤维细胞作用研究

林 朔1，李京向△2，陈宝元3

(1.临沂大学实验中心，山东临沂 276000;2.北京中医药大学东直门医院肛肠科，北京 100700; 3.天津中医药大学第二附属医院中医外科，天津 300150)

目的:通过鼠成纤维细胞株L-929体外培养实验来研究象皮对成纤维细胞生长作用的影响。方法:通过体外培养小鼠成纤维细胞株L-929，并加入生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏的提取液，检测药物对细胞增殖和胶原分泌的影响。结果:生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提物在较高浓度下都能显著促进成纤维细胞的增殖，生肌象皮膏相对于无象皮的生肌象皮膏促进细胞增殖的作用更为明显。结论:象皮可明显促进成纤维细胞的生长，从而促进创面愈合，证明象皮在生肌象皮膏中有重要作用。

象皮;生肌象皮膏;成纤维细胞;体外培养;实验研究

为从细胞分子生物学水平考察生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏两种膏药对疮疡愈合的疗效，有必要建立体外研究模型。本实验引入成纤维细胞培养的方法，通过体外培养小鼠成纤维细胞株L-929并加入生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏的提取液，检测其对细胞增殖和胶原分泌的影响，从而判断生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏对伤口愈合的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器

多功能微孔板分析仪，FlexStation 3，Molecular Devices公司，美国;CO2细胞培养箱，Thermo，美国;一次性针头式滤器，0.22 μm孔径，Millipore公司，美国;细胞培养瓶，96孔、6孔细胞培养板，50 ml离心管，Corning公司，美国。

1.2 材料

小鼠成纤维细胞株L-929自中国药品生物制品检定所引入;培养基采用含有L-谷氨酰胺及丙酮酸钠配方的 DMEM高糖液体培养基(SH30243.01B，Hyclone公司，北京)，加入100 U/L青霉素，100 μg/ ml链霉素，10%胎牛血清(Bioind公司，以色列)，培养条件为37°C，5%CO2;2-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)，SigmaAldrich公司，美国;dimetylsulfoxide(DMSO)，Amresco公司，美国;Trypsin-EDTA溶液，SigmaAldrich公司，美国;羟脯氨酸测试试剂盒(酶消化法)，南京建成生物工程研究所;生肌象皮膏药粉(批号0903026)，天津中医药大学第二附属医院中药制剂室;无象皮的生肌象皮膏药粉(批号0903027)，天津中医药大学第二附属医院中药制剂室。

1.3 方法

1.3.1 生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提取物制备 称取生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏药物粉末各10 g，加入100 ml超纯水室温超声提取1 h，连续2次，合并提取液，4℃、12000 rpm冷冻离心30 min，合并上清液，-20℃冷冻8 h，然后在冷冻干燥机内冷冻干燥，得到生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提取物。实验前精密称取适量，用MilliQ级超纯水溶解，0.22 μm孔径的一次性针头式滤器过滤除菌备用。

1.3.2 成纤维细胞培养 从液氮中取出含有L-929细胞株的冻存管，迅速投入装有37℃温水的密封不锈钢杯中，盖上盖子轻轻振摇使冻存液溶化，75%乙醇消毒冻存管表面后拧开盖子，将含细胞的冻存液倒入50 ml聚丙烯离心管中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，轻摇混匀、密封，1000 r/ min离心5 min。倒掉上清液留下底部沉淀的细胞，加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，用吸管轻轻吹动培养基使细胞成均匀悬液，将细胞悬液种植在25 cm2细胞培养瓶中。培养瓶放入37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养，每48 h换液1次，培养72 h后细胞达到80%融合、传代。

传代方法为倒掉细胞培养瓶中培养基，少量Trypsin-EDTA溶液快速洗涤贴壁细胞表面，倒掉。加入2 ml Trypsin-EDTA溶液，37℃孵育3 min，待细胞成片脱落成流沙状时，加入10 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化。将细胞悬液倒入50 ml聚丙烯离心管中密封，1000 r/min离心5 min。倒掉上清液，留下底部沉淀细胞，加入适量含10%胎牛血清的DMEM培养基，吸管轻吹培养基使细胞成均匀悬液，血细胞计数板计数，将细胞悬液种植到细胞培养瓶或细胞板中继续培养。

1.3.3 细胞增殖实验 将消化后重悬的 L-929细胞配成密度为1×105/ml的细胞悬液种植于96孔培养板中，每孔加入100 μL的细胞悬液。培养板放入37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养24 h后换液，换入含有生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提物的培养基。设置空白对照孔1组，6个平行孔。每组药物浓度设置6个平行孔，在培养基中分别给予125 mg/L、250 mg/L、500 mg/L、1000 mg/ L浓度的生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提物。培养板放入37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养18 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT PBS溶液10 μL，37℃继续孵育4 h吸出培养液，以PBS洗涤细胞表面1次，弃去液体计算加入100 μL的DMSO溶解细胞内生成的甲臜。在多功能微孔板分析仪上测定吸光度，设置检测波长为570 nm。在L-929细胞培养液中加入生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提物，培养24 h后对细胞增殖活性的影响。

1.3.4 成纤维细胞分泌总胶原含量测定 将消化后重悬的L-929细胞配成密度为1×105/ml的细胞悬液，种植于6孔培养板中，每孔加入1 ml的细胞悬液。培养板放入37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养24 h后换液，换入含生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提物的培养基。设置空白对照孔1组，4个平行孔。每组药物浓度设置4个平行孔，在培养基中分别给予125、250、500 mg/L浓度的生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提物。培养板放入37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养48 h后，使用羟脯氨酸测试试剂盒，用消化法检测L-929细胞总胶原的分泌量(以总胶原中的羟脯氨酸计算)。严格按试剂盒说明书操作，用FlexStation 3型酶标仪在550 nm处检测吸光度A值，通过下列公式计算样品中羟脯氨酸及总胶原含量。样品中羟脯氨酸浓度(mg/L)=(测定孔A值-空白孔A值)/(标准孔A值-空白孔A值)。样品中总胶原浓度(mg/L)=样品羟脯氨酸浓度×7.46×稀释倍数(7.46为从羟脯氨酸换算为胶原的计算常数)。

1.3.5 对体外培养成纤维细胞总胶原分泌量的影响 通过木瓜蛋白酶消化成纤维细胞及其细胞外基质，可以将细胞分泌总胶原中的羟脯氨酸游离出来。由于胶原中的羟脯氨酸含量固定，因此通常用测定羟脯氨酸含量的方法简单间接测定胶原含量。在L-929细胞培养液中加入生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提物，培养48 h后用木瓜蛋白酶消化细胞计算细胞消化液中羟脯氨酸的浓度。利用羟脯氨酸与胶原的计算常数，计算出生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提物对L-929细胞总胶原蛋白分泌量的影响。

2 结果

2.1 生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏对体外培养成纤维细胞增殖的影响

表1显示，生肌象皮膏水提物在500 mg/L和1000 mg/L浓度下，能显著促进成纤维细胞增殖(P＜0.05)。无象皮的生肌象皮膏水提物在1000 mg/ L的浓度下，也能显著促进成纤维细胞的增殖(P＜0.05)。在250 mg/L和500 mg/L的浓度下，生肌象皮膏水提物组的细胞活性明显高于无象皮的生肌象皮膏水提物组的细胞活性(P＜0.05)。

表1 生肌象皮膏与无象皮生肌象皮膏对体外培养成纤维细胞增殖的影响(±s)

表1 生肌象皮膏与无象皮生肌象皮膏对体外培养成纤维细胞增殖的影响(±s)

注:与空白对照组比较:*P＜0.05;与同剂量无象皮的生肌象皮膏药物水提物组比较:#P＜0.05

组 别 药物浓度(mg/L) 细胞增殖活性OD(A570nm) 125 250 500 1000给药组 生 肌 象 皮 膏 药 物 水 提 物 0.8053±0.0135 0.8141±0.016# 0.8263±0.0111#* 0.8354±0.0128*无象皮的生肌象皮膏药物水提物 0.7943±0.0125 0.7802±0.0093 0.7981±0.0139 0.8384±0.0095*对照组 空 白 组0.8164±0.0134

2.2 生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏对体外培养成纤维细胞总胶原分泌量的影响

表2显示，生肌象皮膏水提物在125 mg/L和250 mg/L的浓度下，能显著促进成纤维细胞的胶原分泌(P＜0.05)。生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提物在500 mg/L的浓度下，由于作用于L-929细胞的时间较长(48 h)，可能对细胞增殖有一定的抑制作用，因此胶原的分泌量相对于空白对照组和低浓度给药组反而有所降低。

表2 生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提物对L-929细胞总胶原分泌量的影响(±s)

表2 生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏水提物对L-929细胞总胶原分泌量的影响(±s)

注:与空白对照组比较:*P＜0.05

组别 羟脯氨酸(μg/ml)总胶原蛋白(μg/10000个细胞)空 白 对 照 组3.5451±0.3283 0.7934±0.0735无象皮生肌象皮膏125mg/L 3.4357±0.6039 0.7689±0.1352无象皮生肌象皮膏250mg/L 3.8203±0.4906 0.8550±0.1098无象皮生肌象皮膏500mg/L 2.5603±0.4016 0.5730±0.0899生肌象皮膏1 2 5 mg/L 4.3143±0.3080*0.9656±0.0689*生肌象皮 膏2 5 0 mg/L 4.2082±0.2769*0.8609±0.1695*生肌象皮膏5 0 0 mg/L 2.7670±0.4998 0.6917±0.1713

3 讨论

中医外用药物有着悠久的历史。清代名医徐灵胎曾谓:“用膏贴之，闭塞其气，使药性从毛孔而入其腠理，通经贯络或提而出之，或攻而散之，较之服药尤有力，此至妙之法也。”生肌象皮膏是中医外科最具有生肌长皮作用的外用药代表之一，最早出自于张山雷的《疡科纲要》一书，由象皮粉、当归、血余炭、龟板、生地、生炉甘石、生石膏、香油、白蜡组成。方中以象皮粉、生石膏、炉甘石、血余炭为主药，配以滋阴养血、活血化瘀收敛之品，共奏生肌长皮、活血养血之功。

生肌象皮膏用于治疗各种疮疡疾病，在溃疡期脓腐基本已净而皮不生肉不长时应用最佳，多年来生肌象皮膏广泛治疗各种疾病疗效确切，如有效治疗各种慢性溃疡、皮肤损伤、感染伤口及骨髓炎、褥疮、烧伤、糖尿病足病等都有很好的疗效。

因生肌象皮膏的主药象皮来自于亚洲大象的皮肤故正品缺货。《中华人民共和国野生动物保护法》2004年修正版明确规定，禁止猎捕、杀害与交易大象。此外我国2005版《中药大词典》已明确将象皮从该药物中剔除，所以造成临床生肌象皮膏无象皮可用的局面，故象皮在生肌象皮膏中的作用和地位及其代用品研究就显得十分迫切和重要。如临床与实验证实，象皮在生肌象皮膏中具有重要的作用和地位，那么就可进一步开展象皮的代用品研究。

成纤维细胞的增殖及细胞分泌胶原的能力，一直是学术界评价皮肤再生及修复重建的通用标准。所以本实验为验证象皮在生肌象皮膏中具有重要的作用和地位，故引入成纤维细胞培养的方法，通过体外培养小鼠成纤维细胞株L-929，并加入生肌象皮膏与无象皮的生肌象皮膏提取液，检测两者对细胞增殖和胶原分泌的影响。研究证实，生肌象皮膏促进细胞增殖、成纤维细胞分泌胶原的作用更为明显，进一步证明对于促进皮肤的正常结构修复，象皮起到了必不可少的重要作用，说明象皮在生肌象皮膏中确实具有重要作用和地位。因此，寻找疗效相当且能替代象皮的中药、研发象皮代用品、保证生肌象皮膏继续为患者解除疾苦迫在眉睫。

Research of Elephant Skin Effect on Fibroblasts in Vitro

Objective:Study the Elephant Leather effect on fibroblast growth by the culture of Mouse fibroblast cell line L-929.Methods:Having vitro cultured mouse fibroblast cell line L-929，studied on the cell proliferation and collagen secretion by joined extract drugs of Sheng Ji Xiang Pi Ointment and Sheng Ji Xiang Pi Ointment without elephant leather respectively.Result:The water extract drugs of Sheng Ji Xiang Pi Ointment showed better in promoting the proliferation of fibroblasts than the Sheng Ji Xiang Pi Ointment without elephant leather at higher concentrations，and then Sheng Ji Xiang Pi Ointment can promote to proliferate more quickly than the Sheng Ji Xiang Pi Ointment without elephant leather. Conclusion:Elephant Leather significantly promote the growth of fibroblasts，promote wound healing，thereby Elephant leather had an important role in Sheng Ji Xiang Pi Paste.

Elephant Leather;Sheng Ji Xiang Pi Ointment;Fibroblast Cell;Vitro Culture;Experimental Study

R961

:B

:1006-3250(2015)09-1102-03

2015-03-08

林 朔(1971-)，女，医学本科，从事中药外用对动物创面愈合的影响研究。

△通讯作者:李京向(1970-)，男，副主任医师，医学博士，从事中医外科、肛肠疾病、疮疡病的临床与应用研究，Tel: 13436387039，E-mail:bjbjljx2011@126.com。

LIN Shuo1，LI Jing-xiang2△，CHEN Bao-yuan3

(1．Experimental Center，Linyi University，Shandong，Linyi 276000，China;2．Dongzhimen Hospital Affilicated to the Beijing University of Traditional Chinese Medicine，surgery department of Anal，Beijing 100700，China; 3．The Second Hospital affiliated to Tianjin University of TCM，surgery department of TCM，Tianjin 300150，China)