刘艳丽 周妍妍

阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，AD），是一种常见的神经退行性疾病，以渐进性认知障碍为主，伴有明显的社会生活能力减退，给家庭和社会带来严重负担。五味子是木兰科植物五味子的干燥成熟果实，具有补益心肾、宁心安神的作用。五味子的化学成分主要有木脂素、挥发油、有机酸等多种化学成分。五味子醇甲（SCH A）是五味子的主要活性单体成分。研究表明，SCH A 预处理可激活神经元自噬，减轻炎症反应和氧化应激，增强神经营养活性，发挥神经细胞保护作用[1]。本课题组前期研究显示，SCH A 对神经细胞萎缩现象改善，脑组织突触素表达明显增多，α-突触核蛋白表达明显减少，具有神经细胞保护作用[2]。本实验通过研究SCH A 干预Aβ25-35诱导PC12 细胞损伤，观察其对AD 模型细胞氧化应激及炎症因子的影响，探讨SCH A 对Aβ25-35诱导PC12 细胞损伤的神经保护作用。

1 实验材料

1.1 药 物 五味子醇甲（规格：20 mg，批号SS8180），购于中国索莱宝公司。Aβ25-35（规格：5 mg，批号S41991），购于中国源叶生物公司。

1.2 细 胞 PC12 细胞购自普诺赛。细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基于37 ℃、5%CO2的培养箱内培养。

1.3 试 剂 胎牛血清（批号11011-8611），购于中国天杭生物公司。MTT（批号18B120）、细胞凋亡检测试剂盒（批号17B110）、丙二醛（MDA）试剂盒（批号19A100）、谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（批号06A110）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（批号02A070）、白介素-1β（IL-1β）antibody（批号L1202 0891）、白介素-6（IL-6）antibody（批号L12292841）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）antibody（批号M0111158 1）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号02A120）、全蛋白提取试剂盒（批号17A120）、羊抗兔IgG-HRP（批号23A100），均购于沈阳万类生物科技有限公司。

1.4 仪 器 CO2培养箱（HF-90，上海力申公司）；酶标仪（800Ts，美国BIOTEK 公司）；流式细胞仪（NovoCyte，美国Aceabio 公司）；电泳仪（DYY-7C，北京六一公司）；凝胶成像系统（WD-9413B，北京六一公司）。

2 实验方法

2.1 Sch A 干预Aβ25-35诱导PC12 建立细胞损伤及细胞保护模型 Aβ25-35设立空白对照组及1、10、20、30、40 μmol/L 浓度值，作用于PC12 细胞24 h，CCK8检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡率，根据上述检测结果确定细胞损伤模型。SCH A 设置1、5、10、15 μg/mL 浓度作用于细胞损伤模型，MTT 和流式细胞术确立SCH A 对损伤细胞的保护浓度。

2.2 分 组 待细胞生长至对数生长期后，将细胞接种于96 孔板。分为空白组、模型组（20 μM Aβ25-35）和SCH A 组（10 μg/mL SCH A+20 μM Aβ25-35）。

2.3 CCK8 检测细胞活力 细胞培养24h 后加药处理，用不同终浓度的Aβ25-35（1、10、20、30、40 μM）处理细胞。24 h 后进行CCK-8 检测。每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃，5%CO2的培养箱内培养2 h。在酶标仪上测定其在450 nm 处OD 值，进行数据分析。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 将细胞培养于6孔板中，用不同终浓度的Aβ25-35（1、10、20、30、40 μM）处理细胞。24 h 后，各组细胞离心后收集，小心吸除上清，用PBS 洗涤细胞2 次，离心后小心吸除上清，重悬细胞。加入AnnexinV-FITC 混匀后，加入10 μL PropidiumIodide，混匀。室温避光孵育15 min，随即进行流式检测。

2.5 MTT 及流式细胞术检测确立SCH A 实验浓度

2.5.1 MTT 检测 细胞接种于96 孔板，每孔细胞量为4×103个，每组设计5 个复孔。细胞培养24 h 后，进行加药处理，用分别用不同终浓度SCH A 处理24 h 后，再用终浓度为20 μM 的Aβ25-35处理。各组细胞弃去培养基，加入MTT 混合液，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育4 h。然后吸去上清，加入DMSO，避光静置10 min 后在酶标仪上测定其在570 nm 处OD值，进行数据分析。

2.5.2 流式细胞术 调整细胞密度，分别用不同终浓度SCH A 处理24 h 后，再用终浓度为20 μM 的Aβ25-35处理。（其余步骤同前2.4）。

2.6 试剂盒检测氧化相关因子 MDA 采用TBA法，SOD 采用羟胺法，GSH 采用微板法进行检测。将细胞用PBS 重悬，冰浴条件下超声破碎，1500 g 离心10 min，取上清检测。蛋白浓度检测需先进行标准曲线制备，将0.5 μg/μL 的BSA 蛋白标准液按照不同体积分装于酶标板各孔，剩余体积用PBS 缓冲液补齐至20 μL。再进行蛋白质待测液制备，待测样品1 μL 与19 μL PBS 缓冲液混匀。进行BCA 反应，按照A 液∶B 液体积比50∶1 配制BCA 工作液，每孔加200 μL 工作液，于37 ℃反应20 min。570 nm 波长测OD 值。根据标准曲线计算各样本蛋白浓度，并将细胞统一蛋白浓度。

2.7 Western blot 检测细胞相关蛋白表达 细胞处理后，用预冷的PBS 轻洗3 次，吸弃PBS；加入RIPA裂解液；按1∶50 比例加入蛋白酶抑制剂；冰上摇晃20 s，用细胞刮子将细胞刮下，将液体和细胞转移至EP 管中；冰上使用超声破碎仪，超声粉碎、离心，将上清移至新EP 管。用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。配制丙烯酰胺胶，每孔加30 μg 样品；电泳；用0.22 μm PVDF 膜；用5%脱脂牛奶（TBST 配制）室温封闭1 h；按1∶1000 稀释IL-1β、IL-6、TNF-α，按1∶5000 稀释β-actin，4 ℃摇床孵育过夜；一抗、二抗作用后，TBST洗3 次，每次10 min，按1∶1 配制显影液，用凝胶成像仪成像分析。

2.8 统计学方法 应用SPSS 22.0 对实验数据进行统计分析。符合正态分布的数据以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA），两组之间比较采用LSD 检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 Aβ25-35对PC12 细胞活力的影响 通过CCK8、流式细胞仪联合检测，1、10 μmol/L 的Aβ25-35作用于PC12 细胞后，细胞存活率过高，不能诱导出细胞损伤模型。而30、40 μmol/L 的Aβ25-35过度抑制细胞的存活，无法进行后续研究。流式细胞术检测细胞凋亡率，各浓度组结果与CCK8 近似，最后筛选出20 μmol/L Aβ25-35作用于PC12 细胞后，细胞活力和细胞凋亡率建立细胞损伤模型的效果最佳。与空白组比较，除1 μM Aβ25-35浓度组以外，其余各浓度组的OD 值随着Aβ25-35浓度的升高而逐渐降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；比较各浓度组的OD 值，各组间差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

表1 Aβ25-35 诱导下各组PC12 细胞活力比较（）

表1 Aβ25-35 诱导下各组PC12 细胞活力比较（）

注：空白组为正常培养的PC12 细胞；1、10、20、30、40 μM Aβ25-35 各组分别为加入不同浓度Aβ25-35 处理的PC12 细胞；与空白组比较，aP<0.05，bP<0.01；与10 μM Aβ25-35 比较，cP<0.01

3.2 Aβ25-35对PC12 细胞凋亡率的影响 与空白组比较，除1 μM Aβ25-35浓度组以外，其余各浓度组的细胞凋亡率随着Aβ25-35浓度的升高而逐渐升高，差异有统计学意义（P<0.01）；比较各浓度组的凋亡率，各组间差异有统计学意义（P<0.01）。见表2，图1。

图1 Aβ25-35 对PC12 细胞凋亡率的影响

表2 Aβ25-35 诱导下各组PC12 细胞凋亡率比较（%，）

表2 Aβ25-35 诱导下各组PC12 细胞凋亡率比较（%，）

注：空白组为正常培养的PC12 细胞，1、10、20、30、40 μM Aβ25-35 各组为加入不同浓度Aβ25-35 处理的PC12 细胞；与空白组比较，aP<0.01；与10 μM Aβ25-35 比较，bP<0.01

3.3 SCH A 对Aβ25-35诱导的PC12 细胞活力的影响MTT 结果表明，除1 μg/mL SCH A 组外，其他组均可以提高细胞活力，随着浓度的增加，细胞保护作用逐渐加强。流式细胞术结果表明，1、5 μg/mL SCH A组的细胞凋亡率过高，细胞保护作用较弱，而10、15 μg/mL 浓度组的SCH A 能发挥较好的细胞保护作用，明显降低细胞凋亡率。结合两种检测方法，选择10 μg/mL 做为本次实验的药物浓度。与空白组比较，模型组和各浓度SCH A 组的OD 值均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，除1 μg/mL SCH A 组外，其余各浓度组的OD 值均明显升高（P＜0.05，P＜0.01），各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 SCH A 对Aβ25-35 诱导的PC12 细胞活力的影响（）

表3 SCH A 对Aβ25-35 诱导的PC12 细胞活力的影响（）

注：空白组为正常培养的PC12 细胞；模型组为加入20 μmol/L Aβ25-35处理后的PC12 细胞；1、5、10、15 μg/mL SCH A 各组为加入不同浓度SCH A 处理的模型组；SCH A 为五味子醇甲；与空白组比较，aP＜0.01；与模型对照组比较，bP＜0.01

3.4 SCH A 对Aβ25-35诱导PC12 细胞凋亡率的影响与空白组比较，模型组和各浓度的SCH A 组的细胞凋亡率均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，除1、5 μg/mL 的SCH A 组外，10 和15 μg/mL SCH A 组的细胞凋亡率均明显降低（P＜0.01）；比较10 和15 μg/mL 两组，15 μg/mL 的细胞凋亡率更低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表4，图2。

图2 SCH A 对Aβ25-35 诱导的PC12 各组细胞凋亡率的影响

表4 SCH A 对Aβ25-35 诱导的PC12 细胞凋亡率的影响（%，）

表4 SCH A 对Aβ25-35 诱导的PC12 细胞凋亡率的影响（%，）

注：空白组为正常培养的PC12 细胞；模型组为加入20 μmol/L Aβ25-35处理后的PC12 细胞；1、5、10、15 μg/mLSCHA 各组为加入不同浓度SCH A 处理的模型组；SCH A 为五味子醇甲；与空白组比较，aP＜0.01；与模型对照组比较，bP＜0.01；与10 μg/mL SCH A 比较，cP＜0.01

3.5 SCH A 对Aβ25-35诱导PC12 细胞SOD、MDA、GSH 的影响 与空白组比较，模型组SOD、GSH 水平下降，MDA 水平升高，差异有统计学意义（P 均＜0.01）；与模型组比较，10 μg/mL SCH A 组SOD、GSH 水平升高，MDA 水平下降，差异有统计学意义（P 均＜0.01）。见表5。

表5 SCH A 对Aβ25-35 诱导的PC12 细胞SOD、MDA、GSH 的影响（）

表5 SCH A 对Aβ25-35 诱导的PC12 细胞SOD、MDA、GSH 的影响（）

注：空白组为正常培养的PC12 细胞；模型组为加入20 μmol/L Aβ25-35处理后的PC12 细胞；10 μg/mL SCH A 组为浓度10 μg/mL SCH A处理的模型组；SOD 为超氧化物歧化酶；MDA 为丙二醛；GSH 为谷胱甘肽；与空白组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01

3.6 SCH A 对Aβ25-35诱导PC12 细胞IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α 表达水平明显升高（P 均＜0.01）；与模型组比较，SCH A 组IL-1β、IL-6、TNF-α 表达水平明显下降（P 均＜0.01）。见表6，图3。

图3 SCH A 对Aβ25-35 诱导的PC12 炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的蛋白表达

表6 SCH A 对Aβ25-35 诱导的PC12 炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表达的影响（μg/μL，）

表6 SCH A 对Aβ25-35 诱导的PC12 炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表达的影响（μg/μL，）

注：空白组为正常培养的PC12 细胞；模型组为加入20 μmol/L Aβ25-35处理后的PC12 细胞；10 μg/mL SCH A 组为浓度10 μg/mL SCH A处理的模型组；IL-1β 为白介素-1β；IL-6 为白介素-6；TNF-α 为肿瘤坏死因子；与空白组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01

4 讨论

氧化应激是AD 病理过程的重要组成部分。正常情况下，抗氧化剂可能有助于AD 的治疗[3]。这些包括SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽氧还蛋白等。

炎症反应在AD 的发生发展过程中起到重要作用。在AD 病理发展过程中，小胶质细胞过度活化会释放大量的TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎症因子，促炎与抗炎稳态平衡被打破，引发慢性持续性炎症反应，导致神经元损伤和大脑功能障碍[4]。TNF-α 在AD 的炎性反应过程中具有诱发AD 起始及调节细胞因子级联反应的重要作用，可增强炎症反应，最终导致神经元损伤。TNF-α 可协同脑内IL-1 和IL-6 促使神经元表达APP 明显增加，使Aβ 发生沉积，参与脑内炎症反应[5]。

SCH A 是五味子的主要活性单体成分，有多种药理作用，其在中枢神经系统的作用最为显著，对神经退行性疾病（AD、帕金森病）具有潜在的防治作用，如调节改善睡眠作用、抗抑郁作用以及对脑缺血的保护作用等[6]。本研究结果显示，与模型组比较，SCH A 能提高SOD、GSH 水平，降低MDA 水平；能降低细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表达水平。SCH A 各组的炎症因子、氧化应激水平均得到明显改善。

本实验通过MTT、流式细胞仪检测确立20 μmol/L Aβ25-35诱导PC12 建立细胞损伤模型，10 μg/mL SCH A 为本次实验药物剂量。观察SCH A 对Aβ25-35诱导PC12 细胞氧化应激及炎症因子的影响。结果显示，SCH A 能减轻细胞氧化损伤，提高SOD、GSH 水平，降低MDA 水平；降低细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表达水平，表明SCH A 可通过抗炎、抗氧化，从而发挥神经细胞的保护作用。