高 丹 吴 影 李丽娟 李化敏 付雪莲 郭素芬 展 涛

牡丹江医学院附属红旗医院病理诊断中心，黑龙江牡丹江 157000

甲 状 腺 癌（thyroid cancer，TC）发 病 率 约8.7/100 000[1]，乳头状甲状腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）占TC的64.21%，是最常见的甲状腺恶性肿瘤类型[2]。近年来，甲状腺结节发病率日益增多，多数甲状腺结节是“非典型性增生”病变，如果发生迅速增长的甲状腺结节，应怀疑甲状腺恶性肿瘤，但是高效预测TC的检测手段还需要深入探索。Sur等在分子层面检测甲状腺结节组织的炎症基因表达，结果发现PTC常伴有不同程度的甲状腺炎表现。40%PTC病理标本表现出桥本甲状腺炎（hashimoto’s thyroiditis，HT）特征[4]。这不仅证明PTC和HT的病理演变关系，还揭示HT与PTC均有大量T细胞、浆细胞、肥大细胞和巨噬细胞浸润，这反映了免疫系统在HT与PTC区域产生相似作用[5]，虽然进一步解释了HT与PTC的密切关联性，但是这两种疾病的发生、演变的基因表达差异还要深入研究。揭示HT与PTC共同基因，筛查两种疾病的核心蛋白及潜在分子机制，将对判断HT发展和确诊PTC具有重要临床价值。

1 材料与方法

1.1 材料

DisGenet数据库（www.disgenet.org），生物信息学与进化基因组学平台（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn），UniProt数 据 库（www.uniprot.org），Metascape数据库（metascape.org），String 11.0数据库（https://string-db.org）。

1.2 方法

1.2.1 HT和PTC基因表达谱 DisGenet数据库获得C0677607和C0238463数据集，分别为HT和PTC基因表达谱[6]。生物信息学与进化基因组学平台筛选HT和PTC基因表达谱的共同基因。UniProt数据库对共同基因名称进行标准化处理。

1.2.2 蛋白质相互作用和核心蛋白的筛选 String 11.0数据库预测共同基因编码蛋白质的相互作用[7]。Cytoscape3.8的CytoHubba 0.1插件，以Degree值中位数为准筛选核心基因编码的蛋白质。

1.2.3 生物学过程和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 通路富集分析 Metascape数据库对核心蛋白生物学过程和KEGG信号通路进行富集分析[8]。

2 结果

2.1 HT与PTC的共同基因

DisGenet数据库获得HT和PTC差异性基因分别为335个和1348个，147个共同基因，见图1。

图1 桥本氏甲状腺炎与乳头状甲状腺癌差异性基因的Venny图

2.2 蛋白质相互作用与核心蛋白

String 11.0数据库对147个共同基因编码的蛋白质进行蛋白质相互作用网络分析，共有137个节点，2024条连线，见图2A。Degree值中位数为24.5，大 于24.5的核 心蛋 白 质 包 括IL-6、TP53、INS、VEGFA、TNF，见图2B。

图2 桥本氏甲状腺炎与乳头状甲状腺癌的蛋白相互作用网络与核心蛋白的筛选

2.3 细胞增殖和血管发生的生物学过程富集分析

5个核心蛋白的细胞增殖生物过程包括46条，见图3A。Degree值中位数为4，大于4的细胞增殖过程依次是细胞增殖、调节细胞增殖、负调控细胞增殖等21条，见表1，图3A。IL6、TNF核心蛋白与细胞增殖生物过程紧密相关，见图3A。

INS未参与血管发生过程，4个核心蛋白的血管发生生物过程包括22条，图3B。血管发生过程的Degree值中位数为3，大于3的血管发生过程依次是组织重塑、血管生成、血管发育等8条，见表1，图3B。TNF、VEGFA、IL6与血管发生过程相关，图3B。以上结果提示TNF、IL6与甲状腺乳头状癌增殖和转移密切相关，但是分子机制还需要深入研究。

表1 桥本氏甲状腺炎与乳头状甲状腺癌核心蛋白的细胞增殖和血管发生过程富集分析

注 A.5个核心蛋白质与细胞增殖过程的热图。聚类分析采用Pearson相关距离度量和平均链接聚类算法。横轴为核心蛋白质，纵轴表示细胞增殖过程的基因本体论术语。B. 4个核心蛋白质与血管发生过程的热图。聚类分析采用Pearson相关距离度量和平均链接聚类算法。x轴为核心蛋白质，y轴表示血管发生过程的基因本体论术语。

2.4 信号通路富集分析

5个核心蛋白质的KEGG信号通路包括15条信号通路，图4。KEGG信号通路富集分析的Degree值中位数为1，大于1的KEGG信号通路依次是MAPK、人T细胞白血病病毒1感染、Ras等7个通路，表2，见图4。发挥主要KEGG分子信号通路作用的核心蛋白质包括TP53、IL-6、VEGFA，见图4。结果说明KEGG信号通路的核心蛋白与前述细胞增殖或血管发生的基因相一致。

表2 桥本氏甲状腺炎与乳头状甲状腺癌核心蛋白质的KEGG信号通路富集分析

图4 桥本氏甲状腺炎与乳头状甲状腺癌的KEGG信号通路富集分析热图

聚类分析采用Pearson相关距离度量和平均链接聚类算法。横轴为核心蛋白质，纵轴表示KEGG信号通路的基因本体论术语。

3 讨论

TC逐年高发，但是致病原因尚不明确。PTC是TC的重要类型，提前判断PTC的发生或发展趋势，对遏制甲状腺恶性肿瘤的发展具有积极作用。自从1955年首次提出HT以来，HT与TC的关系仍然是研究和争议的焦点[3]。伦语等[9]在切除甲状腺肿瘤组织中常发现HT的淋巴细胞浸润现象。最近对HT进行甲状腺切除术的患者进行免疫学实验及临床回顾性分析表明，HT患者续发PTC的患病率显著增加[4-5]。虽然各方研究结果存在一定差异，但是已经提示HT的淋巴细胞浸润通常与PTC相关，HT可能是发展为PTC的危险因素。

为判断HT和PTC关联性，本试验采用生物信息学技术，分别检测HT和PTC的致病基因。然后利用Venny技术，筛选两种疾病交集基因为两种疾病的共同基因，即获得HT和PTC的共同表达基因。这些共同基因可能是HT继发PTC的关键因素。本研究只采取DisGenet数据库查找两种疾病差异基因，还存在数据量实时更新的问题，后期会持续关注数据库资料变化及新的差异基因。

经过筛查获得HT与PTC共同基因有147个，排名在Degree值中位数前5位的核心蛋白包括IL-6、TP53、INS、VEGFA、TNF。研究发现，IL-6为单核细胞培养必不可少的辅助因子，作为辅助信号激活T细胞，促进Th17细胞活化，对实体瘤发挥持久免疫力[10]。TNF-α能够促进胆管癌和肝细胞癌患者中的外周血单核细胞亚群的频率升高[11]。VEGFA是重要的促进血管生成因子，对血管内皮细胞增殖具有很好的促进作用。TP53是重要的抑癌基因，肝癌患者TP53突变的肿瘤具CD8+T细胞浸润明显下降，导致肿瘤免疫微环境发挥抑制，TP53突变的肝癌患者，其生存时间显著缩短[12]。虽然关于IL-6、TP53、VEGFA、TNF与T细胞、内皮细胞或单核细胞增生相关的研究较多，但是INS与细胞增殖的关系研究却少见报道。

甲状腺结节有无血液供应对诊断结节良恶性非常重要，本研究预测了核心基因与PTC血管新生的关系。结果发现，TNF-α和IL-6及其受体是肾上腺皮质肿瘤组织等肿瘤新血管新生、肿瘤细胞生长的细胞因子[13]。TP53基因具有非常重要调节细胞周期，凋亡和新血管形成功能，50%以上的癌症患者发生该基因突变。TP53基因突变可明显促进恶性肿瘤的发生和发展，从而显著增加患癌的风险[14]。因此，TP53基因编码的p53蛋白已经成为抗肿瘤或抗肿瘤血管生长药物的重要靶标[14]。INS与血管新生关系未见报道，是今后需要关注的研究方向。

IL-6、TP53、VEGFA、TNF核心基因KEGG信号通路包括甲状腺激素信号通路、TC、基底细胞癌等信号通路。研究发现，与健康人相比，良性甲状腺疾病和PTC患者血清IL-6水平明显升高，与良性甲状腺疾病患者相比，PTC患者的甲状腺激素水平明显更高，这与血清IL-6水平增高预示PTC患者的总生存率显著降低的研究相符[15]。研究认为，与健康个体相比，甲状腺良性疾病和PTC患者的血清TNF-α，L-Selectin和VCAM-1显著增高，相对于甲状腺良性疾病，PTC原发肿瘤中TNF-α和L-Selectin的表达也明显更高。L-Selectin和VCAM-1的表达与肿瘤侵袭性行为相关，PTC患者血清TNF-α与L-Selectin水 平 正 相 关，提示TNF-α水平增高预示着PTC转移行为可能高度发生，因此血清TNF-α是乳头状甲状腺癌患者重要预后指标[16]。Heidari 等研究发现TP53在PTC患者明显降低，失去抑癌基因TP53调控的甲状腺组织获得乳头状甲状腺癌易感性而演变为甲状腺癌[17]。Wagner K研究PTC转移因素时发现，发生淋巴结转移的PTC高度表达VEGFA[18]。

虽然本研究预测的HT和PTC关联性以及核心蛋白质的筛选，是基于在线数据库的预测结果，但是已经得到了关于两种疾病的密切关系和潜在分子机制的证据。本研究认为联合检测IL-6、TP53能够有助于判断HT演变和早期诊断PTC，若增加检测TNF-α和VEGFA，将有利于判断PTC是否发生转移，从而指导临床诊断或治疗。