殷 雷 齐 燕 党相国 孙喜波 苗 鑫 胡潇方 李湘奇▲

1.山东第一医科大学第二附属医院乳腺外科，山东泰安 271000；2.山东第一医科大学第二附属医院手术室，山东泰安 271000

乳腺癌现已成为威胁女性健康的主要疾病。近年来，发病年龄逐渐年轻化，发病率亦不断上升。据2020年的全球癌症统计，女性乳腺癌的发病率已超过肺癌成为最常见的癌症，高达226万例新增病例，占癌症患者总数的11.7%[1-2]。2020年，在我国最常见的癌症中，乳腺癌取代了肝癌排名第四，也成为中国女性中最常见的癌症类型，新增病例数量从2015年的30万增加到2020年的42万，占全球乳腺癌的18%[3]。乳腺癌的靶向治疗开启了乳腺癌治疗的新方向，但其治疗效果差强人意。因此，探索乳腺癌转移的潜在机制，寻找特异性的治疗靶点是十分必要的。

肿瘤学研究发现，癌细胞与正常细胞不同，可呈现出低脂状态，即使在氧气充足的条件下也会偏向使用糖酵解作用来取代正常细胞的有氧循环，这也是癌细胞的生长速度远大于正常细胞的原因，即有氧糖酵解或Warburg效应[4-5]。M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2，PKM2）是一种新的肿瘤生物标志物，可产生癌症特异性的Warburg效应，调节葡萄糖的快速摄入，参与了乳腺癌的进展和转移。已有研究发现，PKM2在乳腺癌组织中明显升高，其表达水平与肿瘤分级呈正相关[6]。

近几年，有关PKM2对肿瘤代谢作用的研究报道较多，但其在乳腺癌中作用的报道却不甚详尽，因此探讨PKM2在乳腺癌组织中的表达，对了解乳腺癌的发生发展，寻找乳腺癌治疗的新靶点，具有重要的意义。本研究通过PCR技术检测PKM2在乳腺癌及癌旁组织中的表达水平，并探讨其与临床病理参数间的关系，为乳腺癌寻找新的治疗靶点，或为改善其预后找出新的方向，以期为乳腺癌的治疗提供新的思路及依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2018年10月至2020年10月在山东第一医科大学第二附属医院（我院）收治的经术后病理检查确诊为原发性乳腺癌的患者。纳入标准：①患者均接受手术治疗；②患者入组前未行化疗、放疗、内分泌治疗、靶向治疗等；③患者有可测量病灶，癌组织直径≥2 cm。排除标准：①病例资料不完整的患者；②患有乳腺良性肿瘤及精神疾病者；③妊娠期和哺乳期患者；④因各种主观和客观原因无法配合或退出研究的患者。符合标准的乳腺癌患者共63例，年龄33～84岁，中位年龄为51岁。根据2022年《中国临床肿瘤学会乳腺癌诊疗指南》中关于绝经的标准[7]：绝经前状态患者49例，绝经状态患者14例。左乳腺癌34例，右乳腺癌28例，双乳癌1例。所有研究对象在手术完成后，在完整大标本上从肿瘤中心向外切取部分癌组织（约1.0 cm×1.0 cm），在距癌组织边缘至少＞5 cm处切取癌旁组织（约1.0 cm×1.0 cm），放入液氮，用于PCR检测；远处转移主要依据影像学检查CT、MRI结合核医学骨扫描等情况以及患者随访期间转移病灶情况综合判定。本研究获我院医学和科研伦理委员会批准。

1.2 临床病理参数

63例乳腺癌患者根据美国癌症联合委员会第七版的TNM分期标准[8]：肿瘤大小为T1（直径≤2 cm）患者19例，肿瘤大小为T2（2 cm＜直径≤5 cm）患者38例，肿瘤大小为T3（直径＞5 cm）患者6例。Ⅰ期患者13例，Ⅱ期32例，Ⅲ期及以上18例。肿瘤增殖指数（Ki-67）：低Ki-67（≤30%）34例；高Ki-67（＞30%）29例。以影像学资料及术后病理为标准，有临床淋巴结转移患者35例，无临床淋巴结转移患者28例。

1.3 实验方法

1.3.1 RNA提取及Real-time PCR 使用Thermo Fisher Scientific公司Trizol试剂盒从细胞中提取总RNA，然后使用天根生物科技有限公司产品Quant script RT Kit反转录试剂盒制备cDNA，进行RT检测。通过以下引物检测PKM2 RNA水平上的表达情况，F：5’-AAGGGTGTGAACCTTCCTGG-3’；R：5’-GCTCGACCCCAAACTTCAGA-3’。数据以GAPDH标准化后的相对表达水平显示。GAPDH，F：5’-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3’；R：5’-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3’。PCR反应体系中含2×SuperReal Pre Mix Plus 5 μl，正向引物（10 μm）0.3 μl，反向引物（10 μm）0.3 μl，cDNA模板1 μl，RNase-free dd H2O 3.4 μl，总体积10 μl。反应程序：预变性95℃ 15 min，变性95℃ 20 s，退火56℃ 30 s，延伸68℃ 30 s，40个循环。提取实验CT值，进行结果处理。

1.3.2 结果判断 提取实验CT值，进行结果处理。ΔΔCT法：A=CT（目的基因，待测样本）-CT（内标基因，待测样本），B=CT（目的基因，对照样本）-CT（内标基因，对照样本），K=A-B，表达倍数=2-K。

1.4 统计学处理

采用Graphpad Prism V 9.4软件和SPSS 26.0统计学软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，正态分布或方差齐性采用独立样本t检验，计数资料以例数表示，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

PKM2 mRNA在乳腺癌组织中的表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；低Ki-67组、高Ki-67组、淋巴结阴性组、淋巴结阳性组PKM2 mRNA在乳腺癌组织中的表达量均高于乳腺癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；在乳腺癌组织中，高Ki-67组表达高于低Ki-67组，淋巴结阳性组表达高于淋巴结阴性组，但差异均无统计学意义（P＞ 0.05）。见表1、图1～3。

表1 PKM2在乳腺癌组织及乳腺癌旁组织中的表达量比较（x ± s）

图1 PKM2 mRNA相对表达量在乳腺癌组织与乳腺癌旁组织中比较（＊＊＊P ＜ 0.001）

图2 亚组分析中Ki-67组PKM2 mRNA相对表达量在乳腺癌组织与乳腺癌旁组织中比较（＊＊＊P ＜ 0.001）

图3 亚组分析中淋巴结转移组PKM2 mRNA相对表达量在乳腺癌组织与乳腺癌旁组织中比较（＊＊＊P ＜ 0.001)

3 讨论

乳腺癌具有高度的异质性，无论在免疫表型、组织形态还是生物学行为方面都具有很大的差异，其发生、发展和转移的分子机制很复杂，与很多特异性肿瘤相关因子及复杂的信号通路有关，这决定了其预后也受多方面因素的影响，因此，目前迫切需要找到新的预后指标或治疗靶点，来指导乳腺癌的治疗。

PKM2可产生癌症特异性的Warburg效应，参与乳腺癌的进展和转移。它由四个相同的亚基形成四聚体蛋白，每个亚基（或单体）包含四个结构域，包括A、B、C和N端结构域。单体首先二聚在一起，然后两个二聚体再形成四聚体，这四种同工酶通常都以高活性的四聚体形式存在[9]。而肿瘤生长因子可激活PKM2磷酸化位点，使其处于低活性的二聚体状态，从而使乳腺癌细胞维持糖酵解表型，进入旁路代谢途径进行生物合成；二聚体状态的PKM2也可由细胞质转至细胞核内，参与癌细胞基因转录调控以及信号传导等过程，并作为蛋白激酶磷酸化特殊的核蛋白，从而调控基因的表达，促进癌细胞的生长[10]。

肿瘤学研究发现，PKM2在乳腺癌组织中表达上调，与其预后不良相关，并可通过促进癌细胞活力和侵袭能力来调控肿瘤进展，从而促进乳腺癌转移[11]。PKM2在体内和体外均可以负向调节组蛋白H2B单素化（H2Bub1）的水平，通过部分控制H2Bub1实现了致瘤功能。PKM2-H2Bub1轴可能成为一个有前景的癌症治疗靶点[12]。5-羟色胺可通过分别触发Jak1/STAT3/ERK1/2和腺苷酸环化酶/PKA两种不同的信号通路上调PKM2，从而促进糖酵解及乳腺癌细胞的增殖和代谢[13]。有研究显示[14]，PKM2高表达的新辅助化疗患者的总生存期明显短于PKM2低表达的患者。通过调控PKM2泛素化和降低PKM2稳定性可以介导乳腺癌中紫杉类药物耐药的新信号通路[15]。此外，PKM2抑制剂联合他莫昔芬有可能逆转乳腺癌患者他莫昔芬耐药[16]。因此，可以通过检测肿瘤的PKM2蛋白表达来预测乳腺癌的预后和对化疗及内分泌治疗的敏感性[14]。但也有研究显示，虽然PKM2的敲除会降低癌细胞的生长，但PKM2的敲除会加速同种异体移植肿瘤的生长，从而揭示了PKM2在脂质稳态和癌变中的细胞自主和系统性作用[17]。总之，PKM2在乳腺癌发生及发展过程中发挥着关键性的作用，有可能成为一个潜在的乳腺癌生物标志物和治疗靶点。

本研究结果显示，检测的乳腺癌组织中，PKM2为（1.64±0.06），在乳腺癌中的表达量高于癌旁组织，证明了PKM2作为促癌基因，可在癌组织中高表达，这对预测乳腺癌的发生发展及筛查具有一定的意义。PKM2基因在高Ki-67和淋巴结阳性的乳腺癌组织中表达较高，提示PKM2与乳腺癌病情进展也许存在关系，但仍需大数量样本做进一步研究。

综上所述，PKM2无论肿瘤组织增殖水平高低、淋巴结是否转移，在乳腺癌组织与乳腺癌旁组织间的表达水平均存在差异。本研究存在一定的不足，样本量较少，且来源单一，未能涉及所有类型乳腺癌，且不同临床病理参数做比较时，样本量存在偏倚，存在不可比较的可能性，因此，PKM2可能作为预测乳腺癌发生、发展及预后的潜在性标志，但仍需进一步研究。随着对PKM2研究的深入，对其在细胞质和细胞核中独特的生物学效应的研究将为乳腺癌的治疗提供更广阔的道路，PKM2很可能成为新的潜在靶点，靶向PKM2的药物也将在乳腺癌的治疗中发挥更大的作用。