蓝金金 廖贞金 袁丽萍

1.福建省龙岩市第一医院儿保科，福建龙岩 364000；2.福建省龙岩市第一医院检验科，福建龙岩 364000

遗传代谢病（inherited metabolic diseases，IMDs）是基因突变导致维持机体正常代谢所需的某些酶、载体以及受体合成中出现缺陷导致机体生化代谢发生紊乱，导致在旁路或中间发生蓄积，代谢产物不断缺少，产生一系列临床异常的一大类疾病，其病种繁多、群体发病率高，延误治疗将导致发育障碍、智力低下、病死等不可逆损害[1]。新生儿遗传代谢病串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS）筛查可筛检几十种IMDs。该技术因其具有快速、灵敏、高通量和选择性强等特点，以提高筛查的敏感度和特异度，让IMDs筛查进入新阶段。福建省龙岩市串联质谱项目开展较晚，目前尚无此类研究报道。本文通过对2018年12月11日至2020年12月15日龙岩市新生儿疾病筛查分中心开展串联质谱技术新生儿IMDs筛查项目，对各定点助产机构送检的58 934例新筛进行回顾性分析，分析龙岩地区IMDs情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究分析2018年12月11日至2020年12月15日龙岩市下属的各助产机构送龙岩市新生儿疾病筛查分中心初筛样本共计58 934例，以新生儿干血斑为样本，采用MS/MS进行遗传代谢病筛查。纳入标准：符合《新生儿疾病筛查技术规范》[2]的标准，出生72 h经充分哺乳（6次以上）或7 d以内，以及由于各种原因（早产儿、低体重儿、处于治疗疾病期的新生儿等）最迟不超过20 d的新生儿。排除标准：分娩时已经病死的新生儿；7 d内病死的新生儿；家长不同意进行筛查的新生儿。

1.2 方法

1.2.1 样本采集和递送 采集符合研究标准的新生儿足跟血，滴在专用滤纸片上，收集4个正反面渗透完好的血斑，在室温下自然晾干，再转移到2～6℃环境中存放，采集样本在5 d内送至筛查分中心，经分中心验收合格后进行检测。

1.2.2 仪器与试剂 仪器为美国Waters公司的串联质谱系统，超高效液相色谱串联质谱仪UPLC I-Class/Xevo TQD；试剂为专用的非衍生化多种氨基酸测定试剂、肉碱测定试剂和琥珀酰丙酮测定试剂盒。

1.2.3 检测方法 将滤纸血片打孔3 mm圆形放在96孔微孔板中，使用非衍生化法对样本进行处理，在微孔板中加入琥珀酸丙酮、氨基酸、肉碱的同位素内标萃取液，封膜后，在45℃恒温震荡，萃取45 min，再吸取75 μl到96孔微孔板上，再用铝膜覆盖后链接质谱仪检测。将初筛结果显示阳性或弱阳性的标本召回采血复查，复查后有结果异常的继续召回，召回至龙岩市新生儿疾病筛查分中心临床医生看诊后，继续采血复查，并进行尿液气相色谱-质谱进行有机酸分析和新一代测序技术（next-generation sequencing technology，NGS）检测阳性患儿的突变基因，同时进行临床治疗，并纳入新生儿疾病筛查管理系统进行随访。

1.3 结果判定

氨基酸代谢异常：MS/MS结果显示血苯丙氨酸＞120 μmol/L的患儿予以尿蝶呤谱+二氢蝶啶还原酶分组活性测定，排除四氢生物蝶呤（BH4）缺乏症后血苯丙氨酸≥360 μmol/L的患儿可确诊为苯丙酮尿症，＜360 μmol/L可确诊为轻度高苯丙氨酸血症[3]。

脂肪酸代谢障碍：MS/MS中血浆肉碱持续明显降低确诊为原发性肉碱吸收障碍。

有机酸代谢障碍[4]：患儿给予过尿气相色谱-质谱联用仪（GCMS）明确诊断，戊二酰肉碱，戊二酰肉碱/辛酰肉碱均升高，且基因分析GCDH 2个等位基因具有致病突变可确诊为戊二酸血症Ⅰ型。尿同型胱氨酸检测显示过量含硫氨基酸则诊断为甲基丙二酸血症。

本研究检测结果录入Neolynx软件进行分析，经院内专科医生审核报告后再发放结果。

2 结果

2018年12月11日 至2020年12月15日 共筛查58 934例初筛样本，检出可疑阳性1576例（2.67%），经后续常规检验和NGS检测确定诊断患儿11例，其中确诊原发性肉碱缺乏症（primary carnitine deficiency，PCD）2例，精氨酸血症1例，2-甲基丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症1例，丙酸血症1例，3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症1例，戊二酸血症Ⅰ型1例，高甲硫氨酸血症1例，异丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症1例，2例母源性患者。具体数据见表1～2。

3 讨论

MS/MS是近些年发展起来的分析复杂混合物的技术，与传统色谱-质谱技术更能适应较为复杂的样品分析，样本不经过处理可直接进行分析。串联质谱技术从20世纪80年代应用于新生儿IMDs的筛查中，通过对数十种小分子代谢物的分析，可筛查脂肪酸氧化代谢紊乱、有机酸、氨基酸等代谢疾病。新生儿IMDs的筛查可不断扩展筛查疾病谱，不断提高筛查的敏感度、特异度、准确度等。

在58 934例筛查样本中，初筛出可疑阳性病例1576例（2.67%），召回复查1330例（阳性召回率84.39%），最终确诊9例患者和2例母源性患者（本文未统计PAH、BH4相关病例）。整体发病率约为1/5358，较福建泉州地区发病率低一些[5]，可能是由地区性差异或整体样本量不足导致。虽然，整体发病率低于其他地区，但所检出的疾病都具有重要意义，尤其是发病率（1/19644）较高的PCD。

表2 11例阳性确诊病例的基因检测结果

PCD为临床常见的代谢障碍疾病，主要表现为脂肪酸氧化代谢异常，发病率与种族有关[6-7]，本市的发病率为1/19 644，高于浙江省的1/25 131，而低于同省泉州地区的1/10 126[8]，表明该病可能具有一定的地域差异性。由于PCD临床表现不明显，且无特异性，容易发生误诊或漏诊，有些患者终身不发病但也存在因病致死患者，根据患者临床表现很难早期诊断。此外，新生儿基因突变会导致体内肉碱含量缺乏，直接影响新生儿血中CO水平，在胎儿孕育过程中CO水平偏低是导致新生儿CO偏低的主要原因[9]。本文中的案例11，患儿筛查肉碱远低于正常水平，基因结果却为SLC22A5基因c.428C＞T位点单杂合，而母亲基因结果为同一位点的纯合突变，单纯检测新生儿CO水平不能确诊为PCD患儿，PCD母源性也是主要的发病因素，需要对新生儿母亲进行治疗，以避免对心、肝、脑等器官的损害。

目前在MS/MS中也存在许多问题，具有较强的分析技术，成本仪器较高，并且氨基酸、酰基肉碱分析的试剂价格昂贵，在该技术要求上需要不断丰富实验技能，以释放复杂的代谢途径，在一定程度上限制了在实验室的应用[10]。采用免疫荧光串联质谱测定琥珀酰丙酮未发现假阴性情况。另外新生儿筛查B-胱硫醚合成酶不能作为蛋氨酸的可靠标志物[11]。在采用串联质谱技术应用前多采用细菌抑制法测定血滤纸片蛋氨酸的水平。MS/MS的敏感度在很大程度上依赖于截断值，在低体重新生儿或早产儿倡导外影像会影响酰基肉碱、氨基酸的浓度，特别是在低出生体重的患儿中假阳性率明显高于正常新生儿[12]。出生后年龄直接影响标志物的变化，标志物在出生一周内会发生变化，需要建立不同的胎龄、体重、日龄指标进行截断值的统计，以提高检测指标的参考性，降低假阳性率的发生[13]。

本研究表明，新生儿遗传代谢筛查对遗传疾病诊断有重要意义，通过对新生儿IMDs进行有目的的筛查，可降低新生儿因相关疾病所导致的重要脏器的损害甚至猝死等风险，亦可筛查部分母亲患者，预防成人发病的同时，也为二胎产前诊断提供指导[14]。诸多IMDs的阳性结果不能单一代表代谢物浓度，可试用多参数指导筛查结果，以提高筛查的特异度和敏感度，但有些患儿和母体无明显症状，临床诊断带来困难[15-16]。通过MS/MS可明确筛查出辅酶A脱氢酶缺乏症情况，以降低发病率。串联质谱为多种色谱串联系统，能起到更为准确的分离效率，可明显区分多肽或蛋白质的差别，通过串联质谱进行分析。也可利用阴离子电喷雾串联质谱，通过定量分析胆汁酸水平筛查肝胆管性疾病，在非衍生物下进行分析，以保证筛查结果的准确度。但是本研究中也发现MS/MS存在假阳性较高的情况，考虑与MS/MS筛查时所选择的截断值有关。不同地域的新生儿体内有机酸水平可能存在一定差异，如果使用统一的标准进行筛查，可能会导致不同地域的新生儿出现假阳性或者假阴性诊断结果。因此应该探索各个地区不同的标准，以增加诊断的准确度。

综上所述，新生儿IMDs的MS/MS筛查对新生儿IMDs的早发现、早诊断及早干预具有重要意义，是三级预防的重要手段，对于提高人口质量意义重大。