陆昌彬

复旦大学附属中山医院厦门医院心内科，福建厦门 361015

参松养心胶囊由人参、麦冬、山茱萸、丹参、酸枣仁（炒）、桑寄生、赤芍、甘松、黄连、南五味子、龙骨、土鳖虫组成，具有益气养阴，活血通络，清心安神的功效，可用于治疗室性早搏，气阴两虚，心络瘀阻等临床证型[1]。1990—2013年，在人口老龄化的趋势下，中国患心血管疾病的病死人口数增加了46%[2-4]。研究表明，参松养心胶囊对于冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称“冠心病”）的治疗具有较好的效果[5]，但具体的药理分子机制尚未完全阐明。本研究应用网络药理学的方法，挖掘参松养心胶囊治疗冠心病的作用靶点，探究其治疗冠心病的可能作用机制，为今后冠心病的相关研究提供思路和依据。

1 材料和方法

1.1 参松养心胶囊化学成分及靶点获取

通过检索中药数据库TCMSP（http: //lsp.wsuaf.edu.cn/tcmsp）以 及BATMAN-TCM（http: //bionet.ncpsb.org/batman-tcm），设定口服吸收率（oral absorption，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18作为筛选条件，对所有的成分进行检索。使用Uniprot数据库将检索得到的成分转为相应的靶点。

1.2 冠心病靶点获取

利 用Drugbank数 据 库（https: //go.drugbank.com/）进行关键词“coronary heart disease”检索，并通过Uniprot数据库获取疾病相关靶点。

1.3 药物与疾病共同靶点获取

应用Venny 2.1.0 （bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）对药物和疾病的靶点进行交集，筛选出二者的共同靶点。

1.4 构建“药物-活性成分-共同靶点”网络图

利用Cytoscape 3.7.1软件建立药物-活性成分-共同靶点-疾病的网络图，每个节点（node）代表基因、蛋白或活性成分，节点与节点之间的连接（edge）代表活性成分与其作用靶点之间的联系。

1.5 靶蛋白相互作用网络的构建与分析

将药物与疾病共有靶点导入String数据库，构建参松养心胶囊治疗冠心病的靶蛋白互作网络。限定物种为人类（homo sapiens），设定最低相互作用阈值为中等置信（medium confidence）0.4，其余参数保持不变，得到蛋白相互作用关系，保持为TSV格式。将该TSV格式文件导入Cytoscape 3.7.1软件，进行靶点间网络分析，并进行可视化处理。

1.6 GO功能分析及KEGG信号通路富集分析

将参松养心治疗冠心病的潜在靶点导入DAVID数据库进行基因富集分析。设定Count值＞6，同时以P值＜0.01作为筛选条件，对共同靶点进行GO分析以及KEGG分析。

2 结果

2.1 参松养心胶囊及冠心病主要靶点筛选结果

通过检索参松养心化学成分，去除重复值后，共有185个化学成分。将所有筛选的化学成分导入Uniprot数据库，去除重复值后，最终得到531个药物作用靶点。通过Drugbank数据库进行冠心病疾病靶点检索，共检索到216个。利用Venny 2.1.0绘制韦恩图，同时得到共有靶点44个（图1）。

图1 参松养心胶囊治疗冠心病的药物-疾病共同靶点韦恩图

2.2 PPI网络与核心靶点分析

应用String数据库及Cytoscape 3.7.1绘制靶蛋白-蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）网络图（图2）。筛选出介数和度值大于中位数的靶点作为核心靶点，共得到6个核心靶点，分别为SCN5A、IGHG1、NOS3、PDE3A、HTR2A、KCNH2。土鳖虫、五味子两味中药与冠心病无交集靶点，在药物-活性成分-共同靶点网络中剔除，其中丹参是对应活性成分最多的中药（图3）。

图2 参松养心胶囊治疗冠心病的PPI网络图

图3 参松养心胶囊与冠心病药物-活性成分-共同靶点网络图

2.3 核心靶点生物功能富集分析

应用DAVID数据库进行GO功能富集分析，共筛选出22个条目，其中生物过程（biological process，BP）条目6个，细胞组成（cellular component，CC）条目11个，分子功能（molecular function，MF）相关条目5个（图4）。

图4 参松养心胶囊治疗冠心病的潜在作用靶点的GO分析

GO富集分析表明，生物过程主要包括钾离子跨膜转运、离子跨膜转运的调控等过程。细胞成分主要包括细胞膜、神经树突、电压门控钾通道复合体。分子功能主要包括延迟整流钾通道活性、电压门控钾通道活性等。

利用DAVID数据库进行KEGG信号通路分析，结果显示，主要富集到靶点数量居前3位的信号通路包括5-羟色胺能突触、钙离子信号通路、缝隙连接（图5）。

图5 参松养心胶囊治疗冠心病的潜在作用靶点的KEGG信号通路富集

2.4 药物作用机制分析

药物活性成分-核心靶点-信号通路网络相互作用分析表明，参松养心胶囊中包含的12种活性成分作用主要作用于5-羟色胺能突触、钙离子信号通路。从KEGG信号通路分析结果可得知5-羟色胺能突触涉及9个作用基因，钙离子信号通路涉及8个作用基因。根据药物活性成分-核心靶点-信号通路网络图的Degree值，其中靶标HTR2A、NOS3与此作用过程关系最为密切，可能是参松养心胶囊治疗冠心病的关键靶点（图6）。

图6 参松养心胶囊治疗冠心病的“药物活性成分-核心靶点-信号通路”网络图

3 讨论

本研究采用网络药理学对参松养心胶囊治疗冠心病的作用机制进行探究。结果表明，参松养心胶囊共含有12味中药，有效活性成分共185个，对应的相关靶点共531个，其中冠心病相关靶点216个。冠心病与参松养心胶囊共有基因44个，通过药物-活性成分-共同靶点网络图进行分析，发现丹参在参松养心胶囊治疗冠心病的作用尤为突出。

心血管疾病包括冠心病、风湿性心脏病、周围血管疾病、心力衰竭、先天性心脏病和心肌病等[6]。丹参被广泛用于心血管疾病，例如动脉粥样硬化、心绞痛等[7]，研究表明，丹参可以明显改善胸痛、胸闷、心悸、呼吸急促等临床症状，使冠心病患者心电图逐渐趋于正常[7]。丹参的主要化学成分超过200种，可分为水溶性（亲水性）酚类化合物和非极性（脂溶性）二萜类化合物两大类。丹酚酸和二萜丹参酮是本植物中两种具有代表性的亲水性和亲脂性成分[8]。丹参的心血管保护作用有多种机制，包括抗炎、抗氧化、抗血栓、抗血管平滑肌细胞增殖，抑制血管内皮细胞和白细胞中黏附分子的表达，急性心肌缺血的改善等[9]。

本研究结果显示，HTR2A、NOS3是参松养心胶囊治疗冠心病过程中最核心的靶点。一氧化氮（NO）是最具有特征性的内皮源性舒张因子，当内皮细胞释放NO的能力降低时，可能导致动脉粥样硬化和冠心病等一系列事件[10]，因此，NO在内皮细胞对冠心病的保护中起关键作用[11]。内皮细胞通过提高NOS3的活性来对抗凝血酶和血小板产物的作用在体内外都得到了证实[10]。研究发现，在心肌梗死的发展过程中，NOS3生成减少及活性降低可导致cAMP产生增加，激活蛋白激酶A（PKA）导致L型钙通道的磷酸化和随后的钙内流，进而导致血管平滑肌收缩[12]。应用丹参的主要成分丹酚酸B处理可降低H9C2细胞（胚胎大鼠心室肌源性细胞系）Ca2+和cAMP，抑制PKA[13]，从而发挥舒张血管平滑肌的功能。

5-HT受体分为14种亚型[14]，其中5-HT2A受体在中枢和外周神经系统中介导多种不同的5-HT生理功能，将其阻断是治疗精神分裂症、失眠和缺血性心脏病等多种疾病的有效方法[15]。血管平滑肌细胞的增殖和迁移与动脉粥样硬化的发病机制相关。5-HT可激活血管平滑肌细胞5-HT2A受体，通过内皮细胞中5-HT1B受体的NO依赖机制而引起血管收缩[16]。5-HT2A受体还可以增加细胞内Ca2+水平，释放细胞内储存的Ca2+和/或激活L型Ca2+通道[17]。因此，参松养心胶囊对于冠心病的治疗可能是通过激活NOS3并阻断5-HT2A受体而实现。同时，KEGG信号通路富集分析也发现参松养心胶囊对于冠心病的治疗在5-HT神经突触、钙离子信号通路最为突出。这一与本研究上述的结果一致。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对参松养心胶囊治疗冠心病的作用机制进行了初步研究。结果表明，参松养心胶囊主要通过丹参，辅以其他中药，激活NOS3并阻断5-HT2A受体，同时通过5-羟色胺能突触、钙离子信号通路发挥治疗冠心病的作用。本研究为参松养心胶囊的进一步的基础与临床的研究提供了理论支持。