刘思远，李志刚△，孙润权，刘奕志，王 帅，王 鑫

(1.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029；2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)又称老年性痴呆，是一种老年人常见的中枢神经系统退行性疾病，以学习记忆功能障碍、执行功能障碍与语言功能障碍等为主要症状，严重者可出现人格行为异常等精神症状，且患病率随着年龄的增长而增加。预估到2050年全球AD患者将增至1.52亿。随着我国人口老龄化的加重，AD患病率也呈指数增长，这无疑会给社会和家庭带来沉重的负担。AD已成为当前我国不容忽视的公共卫生、社会经济问题，但其发病机制尚不明确，且尚无可治愈的药物及方法[1]。因此，探讨AD病情进展的机制，寻找新的有效预防和延缓AD的治疗策略具有重要现实意义。

“通督启神”法是李志刚教授经过多年临床实践、结合针刺理论与AD流行病学研究所总结出的一套针法。临床上，“通督启神”法对神志类疾病确有疗效；团队前期的研究证明，“通督启神”法针刺干预可有效提高AD小鼠的学习记忆能力[2]，且能够减少其脑内Aβ沉积[3]，并在透射电镜下观察到AD小鼠脑内自噬空泡及线粒体等囊性细胞器，发现了AD内存在自噬现象[4]。基于此，本实验选取6月龄APP/PS1双转基因小鼠为模型小鼠，采用Morris水迷宫观察其行为学的变化，采用免疫组化、Western blot检测其大脑皮层HIF-1α、BNIP3、Beclin1及PI3K的表达情况，试图探索分析“通督启神”法电针治疗AD的机理。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

选用SPF级健康雄性6月龄APP/PS1双转基因小鼠30只，随机分为3组，分别为模型组(Model group,M)、电针组(Electro-Acupuncture group,EA)和电针+线粒体抑制剂(EA+3MA)，每组各10只；同背景同月龄的C57BL6小鼠10只，为正常对照组(Control group,C)。动物从江苏金致和生物科技有限公司购入[实验动物许可证号:SCXK(京)99 2014-0004]，体质量(28±2)g，常规、单笼饲养于首都医科大学附属北京中医医院实验动物中心屏障系统，室温(24±2)℃，湿度40%～60%。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 试剂 兔单克隆HIF-1α抗体(英国，Abcam，ab179483)；兔单克隆BNIP3抗体(英国，Abcam，ab109362)；兔多克隆Beclin1抗体(中国，武汉三鹰生物技术有限公司，11306-1-AP)；鼠单克隆PI3K抗体(中国，武汉三鹰生物技术有限公司，60225-1-Ig);HRP标记的羊抗兔IgG(中国，Solarbio，SE134);线粒体自噬抑制剂3-MA(美国，Sigma，M9281);苏木素伊红染色试剂盒(中国，碧云天，C0105S)。

1.2.2 仪器 华佗牌电子电疗仪(苏州医疗用品厂有限公司)；无菌针灸针(中国，北京中研太和医疗器械有限公司，规格0.25 mm×13 mm)；Morris水迷宫系统(中国，上海欣软信息科技公司，XR-XM101)；数字病理切片扫描仪(中国，宁波江丰生物信息技术有限公司，KF-PRO-120)；稳压稳流电泳仪(美国，Bio-Rad公司，Powerpac HQ);恒温水浴箱(美国，SHELLAB公司，W20M-2);自制鼠套(规格：长12 cm、宽5 cm，用双层纱布缝制成头部呈尖型的可视、透气网)。

1.3 干预治疗方法

1.3.1 电针组(EA) 电针干预前30 min，腹腔注射PBS缓冲液0.1 mL，将AD小鼠用自制的相同鼠套固定，参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的“实验动物针灸穴位图谱”选取“百会”“印堂”“人中”3穴。选用中研太和规格0.25 mm×13 mm的毫针，用快速点刺方法点刺“人中”穴，不留针；后在“百会”穴、“印堂”穴快速进针，交叉平刺(两针不可相碰，以防电针形成短路)，进针深度为0.5 cm，用胶带固定，针柄连接华佗牌电子电疗仪，频率为1 Hz，电压为2 V，电流强度0.2 mA，电针强度以小鼠头部微颤为宜，1次/d，每次治疗20 min，共治疗15 d。

1.3.2 电针+抑制剂组(EA+3MA) 电针干预前30 min，腹腔注射线粒体自噬抑制剂3MA溶液(0.1 mL，30 mg/kg，用PBS缓冲液制备)，其余干预治疗方法同EA组。

1.3.3 正常对照组(C)与模型组(M) 同电针组(EA)一样腹腔注射PBS缓冲液0.1 mL,将实验小鼠抓取1次并用相同鼠套束缚20 min，但不针刺。

1.4 Morris水迷宫检测

Morris实验系统由水迷宫装置、水迷宫图像自动采集和软件分析系统组成。实验在隔音、非直射光和较暗的房间内进行，圆柱形水池位置、房间明暗度等各种实验条件均保持不变。水池直径90 cm、高50 cm。将水池随意分为4个象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ象限)，并将直径5 cm、高28 cm的圆柱形平台置于Ⅰ象限中央。向水池内注水并加入500 g奶粉，使水呈不透明乳白色，注水深度保持在29 cm(即没过平台1 cm)，水温保持在(24±2)℃。水池上方约2 m处安置的摄像机与图像采集系统相连。实验小鼠均进行熟悉水迷宫环境1 d、隐蔽平台实验4 d及空间探索实验1 d以评价其学习记忆能力的变化。

1.4.1 隐蔽平台实验 实验第1天，让动物在不含平台的水池中自由游泳60 s，上午、下午各1次，使其熟悉迷宫环境。实验时平台位置固定不变，先将动物置于平台上训练10 s，在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ象限分别选一固定位置作为入水点，将小鼠面壁放入水中，记录其自入水到上台的时间和游泳的距离(即逃避潜伏期)，小鼠上台后停5 s，视为上台成功，此时视频采集自动停止。如60 s内找不到平台，逃避潜伏期记为60 s，并将小鼠置于平台上休息10 s。将动物移开、擦干，放回笼内。每天每只鼠各训练1次，共训练4 d。本实验主要测试实验小鼠的空间学习能力。实验选用第Ⅱ象限逃避潜伏期作为观察指标。

1.4.2 空间探索实验 隐蔽平台实验结束后的第6天，拆除平台。将小鼠由Ⅱ象限固定入水点放入水中，记录小鼠60 s内在目标象限游泳路径/总路径、目标象限有用时间/总时间。本实验主要测试实验小鼠的空间记忆能力。实验选用第Ⅱ象限目标象限进入次数、目标象限运动距离作为观察指标。

1.5 免疫组化DAB染色

每组随机选取4只小鼠，0.3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉后，4%多聚甲醛灌注取全脑，放入4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，切片，厚度为6 μm。石蜡切片经常规脱蜡处理后，用枸椽酸缓冲液进行抗原修复15 min，待凉至室温，PBS漂洗；3%H2O2室温孵育10 min，PBS漂洗；正常非免疫羊血清37 ℃孵育10 min，PBS漂洗；一抗稀释液(HIF-1α 1∶100；BNIP3 1∶100；Beclin1 1∶100；PI3K 1∶100)，放入湿盒，4 ℃冰箱孵育过夜；第2天PBS漂洗，生物素标记的羊抗兔IgG 37 ℃孵育10 min，PBS漂洗；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶37 ℃孵育10 min，PBS漂洗；DAB显色试剂盒显色，显微镜下观察并终止显色；苏木素复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，晾干，留以观察。

以额叶皮层部分为图片分析区域，每组取相互不重叠的6个视野，用 Image Pro Plus 6.0图像分析系统进行图像处理，计数其中阳性细胞，每组小鼠所有切片阳性细胞数量作为该组动物免疫阳性细胞密度代表值，以阳性细胞数表示，进一步进行统计分析。

1.6 Western Blot检测

其余6只小鼠，戊巴比妥钠腹腔麻醉后断头处死，迅速剥离大脑，取出大脑皮层置于无菌冻存管中 液氮保存，进行Western Blotting半定量分析。在收集的皮层组织匀浆中加入含有1 mmol·L-1PMSF的蛋白裂解液提取组织的总蛋白，然后4 ℃，10 000 r/min离心10 min, 采用BCA法测定蛋白浓度。配制12%SDS-PAGE分离胶溶液进行电泳，转印蛋白至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭，加入一抗(Beclin1 1∶1 000;BNIP3 1∶1 000;HIF-1α 1∶1 000；PI3K 1∶1 000)，封口，4 ℃过夜，第2天洗膜，加二抗(Beclin1 1∶2 000;BNIP3 1∶1 000;HIF-1α 1∶2 000；PI3K 1∶1 000)37 ℃振荡孵育60 min，加发光液，曝光后显影定影，扫描胶片，用IPP软件对扫描图像的目的条带进行灰度分析。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 Morris水迷宫行为学检测结果

2.1.1 隐蔽平台实验 重复测量和组间效应方差分析，随着天数的增加，逃避潜伏期均有所缩短，差异有统计学意义。正常对照组、模型组与电针组逃避潜伏期的组间差异有统计学意义(P<0.05)，且两两比较模型组逃避潜伏期比正常对照组长，电针组逃避潜伏期短于模型组；电针+抑制剂组逃避潜伏期短于模型组、长于电针组，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。隐蔽平台实验各组小鼠搜索轨迹见图1。

图1 隐蔽平台实验各组小鼠搜索轨迹

2.1.2 空间探索实验 各组空间探索实验目标象限进入次数、运动距离采用单因素ANOVA。与正常对照组相比，模型组小鼠目标象限进入次数、运动距离减少，差异有统计学意义(P<0.05)；其余3组两两比较，电针组、电针+抑制剂组目标象限进入次数、运动距离均高于模型组，电针组高于电针+抑制剂组，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2 免疫组化DAB染色结果

HIF-1α、BNIP3和Beclin1主要表达于细胞质、细胞膜，阳性细胞呈棕褐色。正常对照组阳性细胞着色较深，且表达数量较多；模型组较正常对照组着色明显变浅，表达数量减少；与模型组比较，电针组阳性细胞着色较深，且表达数量明显增多，差异具有统计学意义(P<0.05)，电针+抑制剂组阳性细胞表达多于模型组，差异无统计学意义(P>0.05)。电针组与电针+抑制剂组相比较，阳性细胞着色深，表达数量多，差异有统计学意义(P<0.05))。见表3、图2。

图2 各组小鼠大脑皮层免疫组化染色表达(400×)

2.3 Western Blot检测结果

与正常对照组比较，模型组HIF-1α、BNIP3及Beclin1条带较细，蛋白表达明显较少，PI3K条带增粗，蛋白表达增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，电针组HIF-1α、BNIP3及Beclin1表达均明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，电针+抑制剂组表达也有所增加，但差异均无统计学意义(P<0.05)；电针+抑制剂组与电针组比较其表达明显减少，HIF-1α、BNIP3差异具有统计学意义(P<0.05)，但Beclin1差异无统计学意义(P>0.05)；电针组PI3K表达明显少于模型组和电针+抑制剂组，差异均有统计学意义(P<0.05)，电针+抑制剂组表达含量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图3。

注：1.正常对照组；2.模型组；3.电针组；4.电针+抑制剂组。图3 各组小鼠大脑皮层蛋白表达

3 讨论

AD脑为衰老大脑，其病理变化诸多，如神经炎症、脑白质改变等[5]。脑组织内含有丰富的线粒体，而线粒体是细胞的能量动力源，又是实现神经传递、产生膜电位的基础[6]。当线粒体受损时，一方面可通过与正常线粒体进行融合、修复，严重受损线粒体则主要通过自噬的形式进行靶向降解。因此，线粒体的功能障碍可能是各种精神和神经退行性疾病的发病机制。因此，线粒体功能障碍可能为AD的发病机制之一，而线粒体自噬(Mitophagy)机制可能在清除损伤线粒体缓解AD中发挥着重要作用。缺氧应激下，低氧诱导因子HIF-1α表达发生变化，直接调控脑死亡相关蛋白BNIP3，通过其BH3结构域与Beclin1竞争性的结合抗凋亡蛋白Bcl-2，从而使游离的Beclin1与PI3K形成复合体，参与自噬体形成[7]，激活线粒体自噬[8-9]。

研究发现，APP/PS1双转基因AD模型小鼠在5月龄出现轻微的认知障碍及空间学习与记忆能力障碍[10]，在6月龄后线粒体损伤逐渐加重，且溶酶体降解发生障碍，损伤线粒体因无法得到有效清除而产生累积，且随着月龄增加，损伤逐步加重[11]。就AD模型小鼠的空间记忆能力及保持能力而言，6月龄可能是针灸早期干预的最佳时期[12]。因此本实验选用6月龄APP/PS1双转基因AD模型小鼠。

AD脑血流量减少，影响脑组织获得氧气造成缺氧环境、神经网络受损[2,13]。被认为神经保护因子的HIF-1α对AD具有保护神经、抑制神经毒性的作用[14],可明显抑制缺氧引起的神经元细胞死亡[15-16]。被认为线粒体自噬标记分子之一的细胞死亡相关蛋白BNIP3直接受HIF-1α调控[5]，通过其含有的BH3结构域与Beclin1和抗凋亡蛋白Bcl-2相结合，抑制Bcl-2功能并激活线粒体自噬[6]，同时将Beclin1游离出来。游离的Beclin1通过与PI3K相结合形成复合体，调控下游靶标参与自噬体的形成，参与线粒体自噬，改善受损线粒体的累积[4]。因此，在线粒体自噬水平上调时，HIF-1α、BNIP3及Beclin1的表达可呈不同程度上调趋势，而PI3K表达或呈下调趋势。本实验中，AD小鼠经电针干预后，其空间学习记忆能力得到明显改善，且小鼠大脑皮层中HIF-1α、BNIP3及Beclin1蛋白表达水平上调，PI3K蛋白表达水平下调，该结果表明电针干预明显改善AD小鼠的认知功能障碍和相关蛋白表达水平。而给予3MA自噬抑制剂与电针联合干预的小鼠，行为学检测结果显示其空间学习记忆能力有所改善但比电针组差，大脑皮层HIF-1α、BNIP3及Beclin1蛋白表达水平上调但低于电针组，推测该结果可能与3MA自噬抑制作用和电针治疗作用相抵消有关；其PI3K表达水平较高，该结果可能与BNIP3具有能与LC3相互作用的氨基酸序列有关。BNIP3可介导的线粒体自噬并非仅有Beclin1/PI3K这1条下游通路，其N端具有LIR序列，可与LC3及其同源物γ-氨基丁酸受体相关蛋白(GABARAP)相互作用，也能够介导线粒体自噬从而进行选择性清除[17]。

“通督启神”法选取督脉百会、印堂和人中穴为主，通过针刺手法对AD进行干预。脑为“元神之府”，位于人体高巅之上，为人体一切生命活动的中枢。《素问·骨空论》曰:“督脉，上额交巅，入络脑”，故针刺督脉可起到充养脑髓、开窍醒神的作用。“通督启神”法针刺治疗脑病，必先“调神”，“百会主心烦闷，惊悸健忘，忘前失后，心神恍惚”(《针灸大成》)，百会又名三阳五会，“百病皆主”(《针灸资生经》)，刺之有健脑安神之效。印堂位于两眉正中，属经外奇穴，可镇惊醒神、宁心安神。人中，又名水沟穴，位于鼻柱下，人中沟上1/3与下2/3的交点处，是督脉与手阳明经交会穴，有开窍醒神、镇静安神和调和阴阳之功效，对癫、狂、痫、呆证与抑郁等精神神志类疾病均有较好的疗效。此3穴共用，醒神开窍、充养脑髓和调和阴阳，达邪外出，共奏“通督启神”之效。

综上所述，实验可见，3MA自噬抑制剂可明显加重AD小鼠认知功能障碍，说明AD的发病机制确有可能与线粒体自噬相关；在此基础，与线粒体自噬相关的HIF-1α/BNIP3信号通路，也确有可能对激活/调节线粒体自噬水平起了至关重要的作用。这也为进一步深入研究AD的发病机制提供了新的思路。

本研究选用6月龄雄性APP/PS1小鼠，在证实“通督启神”法电针可有效改善其学习记忆能力的基础上，探索“通督启神”法电针可能的作用机制。本实验研究结果显示，“通督启神”法电针能有效改善模型小鼠的认知功能，提高大脑皮层HIF-1α、BNIP3及Beclin1的表达，减少PI3K的表达。说明“通督启神”法电针对早期AD的治疗确有疗效，其相关机制可能与刺激线粒体自噬、影响HIF-1α/BNIP3信号通路有关。另有研究表明，缺氧导致线粒体产生过量ROS,进一步导致线粒体功能障碍和氧化应激反应[18]。因此，HIF-1α/BNIP3信号通路所介导缺氧环境下的线粒体自噬可能与氧化应激反应密切关联，有待进一步实验探究。