王冠玉，任 怡，孙桂菊

（东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室/营养与食品卫生学系，江苏南京 210009）

0 引言

植物多糖（Plant Polysaccharide）就是植物细胞的代谢过程中所产生的一类生物大分子[1]。植物多糖成分常存在于药食同源的植物和某些药用植物或传统中药中[2]。有些植物多糖有较强的生物学活性，对人类的健康和一些疾病的预防有着重要作用[3]。植物多糖多具备降糖降脂[4]、抗氧化[5-6]、抗肿瘤[7-9]、抗辐射等功能，还有一些植物多糖可以调节人体免疫功能，有助于增强机体免疫力[10-12]。

枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharide，LBP）是提取自我国药食两用中草药枸杞中的重要活性成分[13]。研究表明，枸杞多糖在抗癌、降糖降脂、降血压、免疫调节等方面都有着良好的效果[14]。课题组前期在枸杞多糖的降糖降脂功能方面已经开展了大量研究，探讨了LBP 在大鼠的体内对其组织细胞的代谢的影响及相关分布，针对LBP 有着良好的研究基础[15]。研究希望进一步发掘LBP 在增强免疫力方面的作用，为深入研究和利用LBP 等多糖类物质提供科学依据。灵芝孢子粉（Ganoderma lucidumSpore Powder，GLSP）是灵芝成熟了以后释放的比较小的颗粒状的物质，其主要营养成分有灵芝多糖、三萜类成分等，具有抗癌、免疫增强、护肝等效应[16]。通过查阅相关资料发现，其生理机制可能是灵芝多糖可活化T 淋巴细胞，增强巨噬细胞吞噬功能，促进一氧化氮（NO）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等的产生和释放[17]。

调查发现，目前市面上大部分增强免疫力的保健食品中都含有枸杞多糖和灵芝孢子粉这2 种成分，且枸杞多糖和灵芝孢子粉各自对人体免疫效应有着显著增强作用。为测定其联合作用的最佳配比剂量，首先测定各有效成分的含量，再通过相应的免疫效应试验[18]，探究枸杞多糖和灵芝孢子粉2 种成分在不同配比下免疫调节功能的强弱程度，找到增强免疫力的最佳剂量组合，为相关产品开发提供科学数据资料。

1 材料与方法

1.1 枸杞多糖样品中所含有的有效多糖的成分含量的测定

1.1.1 材料与仪器

枸杞多糖提取物；无水葡萄糖，苯酚，硫酸，乙醇，乙醚。

紫外-可见分光光度计、ME203E 型电子天平。

1.1.2 制备对照品溶液

称25 mg 无水葡萄糖加到250 mL 的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，配成质量浓度为0.1 mg/mL 的无水葡萄糖的水溶液[19]。

1.1.3 制备标准曲线

分别吸取0.1 mg/mL 的所配葡萄糖溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加水至2.0 mL，再加入质量分数为15%的苯酚溶液1 m 和硫酸溶液5 mL，在室温下静置15 min，之后将其放于50 ℃的水浴锅内进行保温10 min，最后用紫外-可见分光光度法，于波长485 nm 处来测定各组溶液的吸光度，绘制标准曲线[20]。

1.1.4 测定方法

称量本样品0.5 g，往样品中加入50 mL 乙醚，加热回流，持续1 h，之后放冷，将乙醚液倒掉，残渣放在水浴锅内将剩余的乙醚挥发掉。加入50 mL的乙醇，进行加热回流，持续1 h，再趁热将溶液进行滤过，滤渣使用20 mL 的乙醇，分多次（至少3 次）洗涤，之后滤渣放在烧瓶中，加水100 mL，进行加热回流，持续2 h。趁热进行滤过，放冷，将洗涤液一并移至250 mL的容量瓶中，加水定容，摇匀后再量取1 mL，置于具塞试管内，加入1 mL水[21]，依据标准曲线制备的方法，从加入5%的苯酚溶液1 mL起，测吸光度，计算含量。

1.2 灵芝孢子粉样品中所含有的多糖、总三萜及甾醇含量测定

1.2.1 材料与仪器

已破壁的灵芝孢子粉、无水葡萄糖、齐墩果酸、香草醛、乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、高氯酸、甲醇。

紫外-可见分光光度计、AL204-IC 型电子天平、SC-2546 型离心机、KQ5200 型超声波清洗器等。

1.2.2 对照品溶液的制备

（1）多糖。无水葡萄糖加蒸馏水配成质量浓度为0.12 mg/mL 的无水葡萄糖的溶液[22]。

（2）三萜及甾醇。适量的齐墩果酸加入甲醇配成质量浓度为0.2 mg/mL 齐墩果酸溶液。

1.2.3 标准曲线的制备

（1）多糖。精密吸取所配对照品溶液，分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，加入蒸馏水2 mL，硫酸蔥酮溶液6 mL，摇匀静置15 min，冰浴冷却15 min，然后用紫外-可见分光光度法，在适宜的波长处测定各组溶液的吸光度，绘制相应的标准曲线。

（2）三萜及甾醇。精密吸取所配的齐墩果酸溶液，分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，挥干后再将其放冷，分别加入香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，再分别加入高氯酸溶液0.8 mL，放于50 ℃的水浴锅中10 min，再冰浴5 min，各加乙酸乙酯溶液2 mL，最后用紫外-可见分光光度法，于波长546 nm 处测定其吸光度，绘制相应的标准曲线[23]。

1.2.4 供试品溶液的制备

（1）多糖。将2 g 样品粉末放在250 mL 的圆底烧瓶中，加50 mL 水后，在室温下静置1 h，同时搭建加热回流装置，静置结束后令其加热回流持续4 h，之后过滤洗涤，再加50 mL 水加热回流持续2 h，再过滤挥干，往残渣里加入乙醇100 mL，然后摇匀，在25 ℃条件下放10 h，离心，把上清倒掉，加适量的热水溶解后放到100 mL 的容量瓶中，定容后吸取适量该溶液，离心取上清2 mL，置于25 mL 的容量瓶中定容。

（2）三萜及甾醇。称取5 g 样品，加100 mL 乙醇，超声1 h，过滤，之后将滤液置于200 mL 的量瓶，乙醇分多次（至少3 次）洗涤滤渣，洗涤液用引流棒全部倒入容量瓶，最后加入乙醇定容。

1.2.5 测定方法

（1）多糖。吸取2 mL 刚刚配制的供试品溶液，依据标上述方法，从“加入6 mL 的硫酸蔥酮溶液”开始，试验操作步骤完全一致，测定所配置的供试品溶液的吸光度，带入公式计算含量。

（2）三萜及甾醇。精密地量取刚刚新配制0.5 mL所配供试品溶液，转移到15 m：试管内，依据上述方法，从“挥干”开始，试验操作步骤完全一致，测定所配置的供试品溶液的吸光度，带入公式计算含量。

1.3 试验项目

单核-巨噬细胞功能的相关测定[24]：小鼠碳廓清试验。

1.3.1 原理

在一定的范围内，经小鼠尾静脉注射扩散至全身的碳颗粒在一定时间内含量会递减，减少的速率通过内眦静脉血中的碳浓度反应，减少得越快，光密度值相差越大，细胞吞噬能力越强。

1.3.2 试验动物

18～22 g BALB/C 小鼠，SPF 级，雄性，每组10 只，共90 只，随机分组。

1.3.3 剂量设计和选择

根据文献资料，选择枸杞多糖和灵芝孢子粉的剂量范围[25-32]。

枸杞多糖与灵芝孢子粉复方二因素六水平见表1。

表1 枸杞多糖与灵芝孢子粉复方二因素六水平/ mg·kg-1 BW

1.3.4 将试验动物进行随机分组

采用均匀设计法，以枸杞多糖和灵芝孢子粉为组成，设计二因素六水平均匀设计表，同时设置阴性对照组。同时设置一组枸杞多糖700 mg/kg BW（不添加灵芝孢子粉），另一组灵芝孢子粉700 mg/kg BW（不添加枸杞多糖），共9 组。为期45 d。

枸杞多糖与灵芝孢子粉复方二因素六水平的均匀设计见表2。

表2 枸杞多糖与灵芝孢子粉复方二因素六水平的均匀设计/ mg·kg-1 BW

1.3.5 溶液配制

将现配5 mL 印度墨汁中加入提前准好的生理盐水20 mL。

配制Na2CO3溶液时，用天平准确精密地称取0.2 g Na2CO3粉末，转移至200 mL 容量瓶中，然后加入蒸馏水至刻度线定容。

1.3.6 注射墨汁

找准小鼠的尾部静脉，按照规定的剂量注射（10 mL/kg BW）[33]，一旦成功注入了试验小鼠的尾巴，进入全身血液，则立即使用计时器开始计时。

1.3.7 测定

一共从小鼠的内眦静脉丛取2 次血，成功地注入印度墨汁后的2 min 为第一次取血，取血量为每次20 μL。使用分光光度计在适宜的波长600 nm 处测其OD1。在取完第1 次血后再计时8 min，到点重复上述操作测其OD2，两者进行比较。

1.3.8 数据处理及结果判定

吞噬速率用K 表示，计算公式如下，若受试样品组K 值显著高过对照组K 值，则可以判断这项试验的结果阳性。因为动物本身的体重和肝脾质量会影响小鼠清除体内碳颗粒的速率，所以一般是采用校正的吞噬指数来表示小鼠碳廓清的能力（见下式）。

2 结果与分析

2.1 枸杞多糖有效成分质量浓度测定的标准曲线及测定结果

以葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法测枸杞多糖有效成分的质量浓度，以5 组质量浓度标准品作为横坐标，将其不同质量浓度标准品的吸光度作为纵坐标，可以得到以下的标准曲线。所测得的样品吸光度为0.412，计算可得样品枸杞多糖有效成分质量浓度为0.42 mg/mL。

枸杞多糖有效成分质量浓度测定的标准曲线见图1。

图1 枸杞多糖有效成分质量浓度测定的标准曲线

2.2 灵芝孢子粉样品中多糖、总三萜及甾醇质量浓度测定的标准曲线及测定结果

以葡萄糖为对照品测灵芝孢子粉多糖的质量浓度，以5 组标准品的质量浓度为横坐标，取其吸光度为纵坐标，描绘标准曲线。样品吸光度为0.247，根据标准曲线可得样品灵芝孢子粉多糖质量浓度为0.349 mg/mL。

灵芝孢子粉多糖质量浓度测定的标准曲线见图2。

图2 灵芝孢子粉多糖质量浓度测定的标准曲线

使用齐墩果酸作为对照品来进行灵芝孢子粉总三萜及甾醇质量浓度的检测，以5 组不同质量浓度的标准品作为横坐标，取其吸光度为纵坐标，描绘标准曲线。样品吸光度为0.576，根据标准曲线可得样品灵芝孢子粉总三萜及甾醇质量浓度为0.308 mg/mL。

灵芝孢子粉总三萜及甾醇含量测定的标准曲线见图3。

图3 灵芝孢子粉总三萜及甾醇质量浓度测定的标准曲线

2.3 小鼠碳廓清试验结果

2.3.1 试验结果

45 d 干预结束后，进行碳廓清试验。

各组吞噬指数、体重、肝指数和脾指数结果比较见表3。

表3 各组吞噬指数、体重、肝指数和脾指数结果比较

2.3.2 直观分析法评价结果

吞噬指数能够直观反映吞噬细胞的吞噬活力，也即是机体非特异性免疫的能力，如果以吞噬指数作为评价免疫功能的标准，可知单独700 mg/kg 的LPB 组为最优组。

脾指数代表了小鼠免疫器官的相对大小，是衡量机体免疫功能的指标之一，肝指数则可以反映小鼠的肝脏功能。如果以脾指数为标准，可知LBP 700 mg/kg GLSP 350 mg/kg 组为最优组；如果以肝指数为标准，可知单独700 mg/kg 的LPB 组为最优组。

2.3.3 多元二项式回归模型分析结果

考虑到LPB 和GLSP 之间可能存在的联合作用和其他数学关系，结合研究实际，回归模型确定为二次二项式回归模型，依据二项式回归模型，回归方程为[34]：

在SPSS 统计软件中采用逐步后退法，LBP 得到吞噬指数的回归方程为：

偏回归系数R=0.885，决定系数Rr=0.783，说明该模型对数据的拟合程度较高。

同样，脾指数的回归方程为：

偏回归系数R=0.942，决定系数R2=0.888，说明该模型对数据的拟合程度较高。

肝指数与LBP 和GLSP 的关系不符合线性模型，无法求得回归方程。

2.3.4 通过回归方程寻找最佳因素水平组合

本均匀设计是36 个全面试验的部分实施，其中最好的试验点为单独700 mg/kg 的LPB 组（吞噬指数最高、肝指数最低）或LBP 700 mg/kg GLSP 350 mg/kg组（脾指数最高）。但这种组合不一定是全局最优，试图通过回归方程找到更好的组合。

由于在查阅文献资料的过程中没有找到吞噬系数和脾指数在评价小鼠免疫功能时的权重分布，所以将进行分别讨论。

使用Excel 提供的规划求解工具，根据回归方程计算出能够获得最大吞噬指数的最优组合，即LBP 700 mg/kg GLSP 35 mg/kg 组。

吞噬指数的规划求解结果见表4。

表4 吞噬指数的规划求解结果

同时由于是优化试验，也用Surfer 11 画出了吞噬指数的等值线图。

吞噬指数的等值线图见图4。

图4 吞噬指数的等值线图

同理，使用Excel 规划求解工具求得能够获得最大脾指数的最优组合，即LBP 700 mg/kg GLSP 700 mg/kg。

脾指数的规划求解结果见表5，脾指数的等值线图见图5。

表5 脾指数的规划求解结果

图5 脾指数的等值线图

3 结论

均匀设计法主要考虑试验点“均匀分散性”，而不是“整齐可比性”，因此它能大幅度减少试验次数，提高试验效率，但同时也因此使得组间可比性降低。均匀设计常使用多元回归分析，通过拟合回归模型预测最佳试验结果，精确度较高但过程较为复杂，且目前均匀设计回归分析的一般步骤与方法尚不明晰[35]。

试验为配方优化试验，根据试验结果可知，单纯700 mg/kg 的LPB 组的吞噬指数平均得分为4.789＞4.758。出现这种结果的原因可能是：均匀设计法以及后续的回归分析时没有并且也不应该包含单独700 mg/kg 的LPB 组，因此拟合回归方程的过程中不涉及单独LBP 700 mg/kg 组，求得的最优解LBP 700 mg/kg GLSP 350 mg/kg 组与单独700 mg/kg的LPB 组不可比。根据回归方程求得的脾指数最大组合为LBP 700 mg/kg GLSP 700 mg/kg，此时脾指数为4.851 大于9 组试验点中的最大值4.788。

从产品研发的角度来说，并不需要一味追求吞噬指数或脾指数的最大化，相关保健食品应该在综合考虑LBP 和GLSP 的原料成本的基础上，找到最合适的相对免疫促进最大化的配比组合。从等值线图的结果来看，LBP 180 mg/kg GLSP 80 mg/kg 就可以达到4.55 左右的吞噬指数水平，相比于空白对照组已经提升了15%，应该是最具性价比的配比方案。虽然存在边际效益递减，但如果研发商需要做出差异化、区分度，也可以选择更高水平的LBP 和GLSP配比。

根据脾指数的回归方程和等值线图可以看出，相比于GLSP，LBP 对于脾指数的影响更大且更为均衡，因此在不考虑两者原料价格的情况下，应该首选增加LBP 含量来获得的免疫效应增加。肝指数可以衡量小鼠肝脏的健康程度，也会影响碳廓清试验小鼠巨噬细胞的吞噬速率，但是在回归分析中肝指数没有表现出与LBP 和GLSP 之间存在线性或非线性回归关系，所以将其作为次级指标，在主要指标相同时辅助选择。

吞噬指数反映机体单核-巨噬细胞的吞噬功能，脾指数反映脾脏的发育情况，与机体的细胞免疫能力有关，两者代表机体免疫功能不同方面，因此无法通过权重法合并。综合考虑两者，免疫功能最大化的组合应该为LBP 700mg/kg GLSP 700 mg/kg，考虑原料成本的最具性价比组合应该在LBP 500 mg/kg GLSP 200 mg/kg 左右。