程 旭，范建华，高明燕，俞 燕，张 莹，姜 逸，贾学波

（中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州 225125）

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的高度接触性的传染病。IBV 主要攻击呼吸系统、消化系统、生殖系统、泌尿系统，可引起呼吸道症状、产蛋鸡产蛋质量下降，并具有高病死率，特别是雏鸡感染后易诱发细菌或病毒继发感染，混合感染后可导致病死率上升[1-2]。目前世界范围内流行多种IBV血清型，大多数国家经典型和变异型IBV血清型共存，导致IB防控成为一项全球性挑战。

IB现有防控措施主要是疫苗接种，但在自然选择和免疫压力下，新的IBV 血清型不断出现，目前已有超过50 种血清型，且各血清型之间交叉保护性较差，部分甚至没有保护[3]。同时由于新的血清型在外部环境中可能成为主要流行毒株，现有的疫苗株将逐渐被取代，故有必要研究开发新型疫苗[4]。本文对国内外现有的IB 疫苗应用情况及新型疫苗的研究进展进行综述，以期为今后IB疫苗的研发应用提供参考。

1 弱毒疫苗

IB弱毒疫苗一般是将野生毒株通过鸡胚传代，减弱病毒毒力而获得，生产成本低且使用方便。IB弱毒疫苗可激发体液免疫和细胞免疫，是雏鸡初次免疫的最佳疫苗。减毒活疫苗接种后的免疫持续时间较短，接种后2～3周需要使用相同或其他毒株的组合进行强化免疫。

目前世界上应用最广泛的是H120 活疫苗，但该呼吸型疫苗现已无法对IBV 流行株提供足够保护率。由于IBV存在地区差异性，应选择与本地区流行毒株基因型一致的弱毒疫苗株，提供有效的针对性保护，还可降低弱毒苗导致基因重组的风险，如美国经常使用M41、H120以及阿肯色州、特拉华州、佛罗里达州和JMK衍生的疫苗；澳大利亚使用B株和C株；英国选择的疫苗株包括M41、4/91和CR88；荷兰使用D274和D1466进行疫苗接种。

国内现有的弱毒疫苗毒株包括H120、H52、M41、W93、Ma5、LDT3，上述疫苗均为Mass血清型，针对呼吸型IBV；此外还有QX 株、4/91 株等非Mass 型疫苗。李玉杰等[5]通过流行病学调查发现，QX型是我国目前主要流行的基因型。2011年获批的LDT3-A与国内流行的QX株关系最为接近，2017年获批的NNA株为4/91型疫苗，2018年获批的QX87株为国内首个QX型活疫苗[6]。鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗（LaSota株+QX87株）由流行QX株传代致弱获得，是国内唯一上市的QX型活疫苗，可获得良好的临床保护效果[7]。

2 灭活疫苗

IB 灭活疫苗是将IBV 灭活后加入免疫佐剂制备的油乳剂苗，灭活疫苗可单独使用，也可与IBV 减毒活疫苗结合使用。IBV 灭活苗一般与新城疫、禽流感组成多联苗，适用于3月龄以上的鸡及种鸡的免疫。与弱毒苗相比，灭活疫苗可有效激发体液免疫，但免疫剂量较大，抗体应答时间较长[8]。因此，在大多数情况下，灭活疫苗需要使用弱毒疫苗作初次免疫或多次接种。Ahmad 等[9]对1 日龄的SPF雏鸡接种H120减毒活疫苗，并在3周后接种M41灭活疫苗；第二次接种后2 周，采用爱德士（IDEXX）抗体检测试剂盒检测，结果显示，弱毒苗加灭活苗组抗体水平显著高于单独使用H120弱毒苗组。

灭活苗免疫效果与免疫佐剂也具有一定的关系。Priscila 等[10]比较了壳聚糖纳米颗粒与油佐剂制备IBV 灭活苗后的免疫效果，结果显示，采用壳聚糖纳米颗粒作为疫苗载体佐剂制备的IBV灭活疫苗，在单次免疫鸡后可激发更高水平的免疫球蛋白A（IgA）抗体，并具有更高的记忆表达水平；免疫弱毒疫苗后，采用壳聚糖纳米颗粒灭活疫苗加强免疫，可表现出更高的抗体水平和更高的CMI相关基因表达。

3 基因工程苗

3.1 病毒载体疫苗

病毒载体疫苗是采用一种病毒的免疫基因整合到另一种病毒基因DNA的片段中构成重组活载体疫苗。接种动物体内后，整合的免疫基因可进行有效表达。常见的载体病毒主要包括腺病毒、新城疫病毒、禽痘病毒、疱疹病毒等。Wang等[11]采用鸡痘病毒表达IBV的S1基因构建了重组疫苗RFPV-S1，结果显示，接种该疫苗的免疫鸡能够产生IBV 特异性抗体；攻毒试验结果表明，该重组疫苗能够有效降低病毒组织载量，缓解气管组织病变。田占成等[12]研究发现，采用鸡痘病毒重组表达IBV S1基因能够产生中和抗体，攻毒后能够提供部分保护，有效降低病理损伤并缩短排毒时间。

NDV是一种合适的病毒载体，广泛应用于动物传染病疫苗的研发[13-14]。Abozeid等[15]将埃及IBV流行株的S1基因在NDV上重组表达，攻毒保护试验结果显示，该重组疫苗可对鸡群提供有效保护。Tan等[16]使用反向遗传系统表达了IBV S1 多表位盒，成功构建了重组LaSota 候选疫苗株rNDV-IBV-T/B，并将该疫苗株接种于1日龄SPF雏鸡；结果显示，3周龄时，该疫苗对IBV强毒M41的保护率达到90%，纤毛稳定性得分为4.2，显著高于对照组，表明该重组疫苗有效降低了IBV 对气管的致病性；RT-PCR 分析显示，疫苗组气管内病毒载量较低。

Tan等[17]将IBV的多表位盒（S-T/B）与NDV LaSota株重组成耐热候选活疫苗rLS-T-HN-T/B，将该重组苗免疫1 日龄雏鸡，3 周后进行攻击试验；结果表明，与对照组相比，疫苗组IBV保护率为90%。Zhao等[18]采用LX4型IBV的S1基因构建了重组LaSota株（rLaSota-S1），通过间接免疫荧光法和Western Blot 发现S1蛋白能够有效表达；疫苗接种结果显示，接种rLaSota-S1可诱导IBV特异性免疫球蛋白G（IgG）抗体，但单次疫苗接种提供了部分保护，加强免疫后具有更好的保护效力。

3.2 亚单位疫苗

病毒的保护性抗原基因与质粒或病毒载体重组后在受体中高效表达，提纯的表达产物加入佐剂制成的疫苗即为亚单位疫苗。亚单位疫苗来自病原体蛋白质或多糖，不含核酸，无致病性，安全性极高。其中多表位疫苗能够同时保护两种或多种病原的感染，具有免疫原性好、生产成本低等优点。因此，开发多表位IBV疫苗对于同时预防多种亚型IBV具有重要的生产意义。

IBV的主要抗原表位在S1蛋白上，N蛋白上也存在部分中和抗原表位。苏艳静等[19]采用昆虫杆状表达系统表达IBV S1蛋白，表达后的S1蛋白1 mg与弗氏完全佐剂乳化后皮下注射，2周后加强免疫3次，每次间隔1周，免疫剂量减半，最后一次免疫后10 d采血分离血清；结果显示，新西兰大白兔免疫后产生的特异性抗体反应性良好，表明S1蛋白免疫原性良好。阳泰等[20]以IBV SAIBK 株全基因组序列，对结构蛋白S1、S2、N、M进行二级结构分析；抗原表位预测结果表明，S1 和N 结构蛋白具有较好的亲水性，N结构蛋白抗原指数最高，能够激发CTL 反应。Yang 等[21]将免疫原性肽融合到谷胱甘肽S转移酶基因（GST）的3'末端，并于大肠杆菌中表达；经ELISA和Western Blot分析表明，纯化的融合蛋白与鸡抗IBV 血清具有良好的反应活性；在疫苗接种过程中，候选肽疫苗诱导了强烈的体液和细胞反应，并提供了80% 的免疫保护，而阴性对照组的鸡均表现典型症状并出现死亡情况。

虽然S1 蛋白免疫原性良好，但S1 蛋白抗原性对空间结构的依赖程度较大，表达系统对蛋白的修饰可能会削弱亚单位疫苗的免疫保护作用，而N蛋白的保守型及高抗原指数提示可成为疫苗研发的备选方案。

4 核酸疫苗

核酸疫苗也称基因疫苗，是将病原体的DNA 或RNA直接注入动物机体，使动物机体产生针对性抗原，并对该抗原产生免疫应答，从而获得免疫保护。由于核酸疫苗存在诱发肿瘤以及异常自身免疫的危险，故迄今为止，市场上尚无获得许可的家禽DNA 疫苗。然而，该技术已得到了许多关注，已有几种产品处于不同的开发或试验阶段。

Yan 等[22]采用IBV 强毒株SX16 的S1、N 和M 蛋白构建 了 质 粒pVAX1-16S1、pVAX1-16N、pVAX1-16M、pVAX1-16S1/M/N，对鸡进行单价免疫和多价免疫，结果显示，pVAX1-16S1/M/N免疫鸡的抗体滴度明显高于单价组，同时对攻毒保护率高达90%。Tian 等[23]研究发现，将S1、S2和N通过脂质体包裹形成多表位DNA疫苗，肌肉注射至7 日龄鸡体内，2 周后加强免疫，可有效激发细胞免疫，增加CD4+、CD3+和CD8+、CD3+细胞数量；加强免疫后5周采用强毒IBV攻击，免疫鸡获得80%的保护率。

刘芳等[24]将S1 基因的T 细胞抗原表位盒、Australia T株和M41 株S1 基因的B 细胞抗原表位，定向克隆入真核表达载体pVAX1，构建成5个真核表达质粒：pVAX-S1T+M41、pVAXS1B-M41、pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1BM41、pVAX-S1T+S1B-T；质粒溶液通过腿部肌肉注射7日龄SPF雏鸡，28日龄时加强免疫1次，二免后10 d采用IBV 病毒液攻毒测定保护率；结果显示，二免后10 d，各免疫组抗体达到最高，4个质粒组与PBS组相比差异显著；攻毒结果表明，pVAX-S1、pVAX-S1B-T 组的保护率均为75%，表明表位抗原成分能够有效发挥保护效力。

5 病毒颗粒样疫苗

病毒样颗粒（VLPs）由病毒的一个或多个结构蛋白组装而成，不含病毒核酸，在结构上和天然病毒相似，具有很强的免疫原性。VLPs 无法在体内复制，因而具有很高的安全性，是研制安全高效IBV候选疫苗的方向。

刘根梅等[25]将IBV 的M、S 蛋白与重组杆状病毒大量感染昆虫细胞，通过浓缩纯化后获得VLPs；VLPs颈部皮下注射SPF鸡，10 d首免，14 d二免，结果显示，该颗粒样疫苗产生的免疫水平与IBV灭活苗免疫效果相当。Zhang等[26]构建了携带IBV S、M、E蛋白的SME-VLPs，SME-VLPs诱导的中和抗体与灭活疫苗诱导的中和抗体应答相当，高于市售活疫苗H120诱导的中和抗体；同时SME VLPs能够诱导细胞、体液及黏膜免疫应答，使CD4+和CD8+T淋巴细胞水平增高，也能够诱导更高水平的白细胞介素-4（IL-4）和γ干扰素（IFN-γ）。

6 反向遗传基因疫苗

反向基因疫苗是借助反向遗传操作技术对病毒进行人工改造后制备的疫苗。反向遗传技术可对所分离的流行毒株进行基因定点改造和修饰，使其能够满足作为疫苗候选株的条件，保证其与流行毒株具有很好的抗原匹配性，并具有稳定的遗传特性。

Armesto 等[27]采用致病性M41 和欧洲4/91 株S1 基 因替换无致病性Beau IBV 株的抗原S1 糖蛋白，构建了重组BeauR IBV 疫苗，使重组病毒获得了保护性免疫且不具有致病性。Zhou等[28]构建了重组改造的H120（R-H120），在鸡胚中经过5 次传代后拯救，结果显示，与完整的H120 疫苗接种组相比，使用该疫苗可诱导高水平的血凝抑制抗体滴度，具有更高的保护率。周生等[29]构建了以H120 疫苗株为骨架，流行毒株IBYZ 株S 基因替换构建了全长cDNA，并借助反向遗传操作技术拯救病毒，成功获得重组H120-ΔS/IBYZ株；经试验，该毒株具有良好的遗传稳定性和免疫原性，以重组病毒免疫SPF 鸡后，对同型毒株保护率可达100%。

Jiang 等[30]以H120 疫苗株为骨架，利用反向遗传系统将致病株ck/CH/IBYZ/2011的S1基因进行替换，构建了重组株rH120-S1/YZ。鸡胚矮小化、生长动力学和鸡胚病毒滴定的结果表明，重组病毒的生物学特性保持不变。将重组病毒接种于SPF雏鸡，结果显示，与rIBYZ感染组相比，接种rH120-S1/YZ的雏鸡未出现临床症状或死亡情况，肺部或肾脏未观察到病变；且组织、泄殖腔和口腔拭子中的病毒载量较低，表明rH120-S1/YZ毒株在雏鸡中安全性很高。疫苗保护评估显示，rH120-S1/YZ 具有更好的保护性，接种的雏鸡存活率为100%，且未观察到任何疾病症状或严重损伤。

反向遗传技术不仅可以纯化毒株，也能够从全基因组上对病毒进行改造，保留免疫相关基因，甚至剔除毒力相关基因，消除病毒毒性反强的危险，可快速研发针对流行毒株的疫苗，提升疫苗的纯度及免疫针对性。

7 结论

IB目前是继禽流感、新城疫后影响养鸡业最重要的病毒性传染病，对于该病的防控主要依靠疫苗接种、环境消毒、提升饲养管理水平等综合措施。IBV由于套式转录方式和RNA酶无校正能力，病毒基因组存在高变异性，导致出现的基因型较多，毒力差异和组织嗜性也存在差异。目前使用的弱毒苗加灭活苗方式已无法提供足够保护，存在一定的缺陷。弱毒苗由于致弱效果难以控制，可能存在毒力返强的情况，具有一定的致病性和传播力，且存在毒株的变异及与野毒株的重组危险，故弱毒疫苗的选择和使用需格外谨慎。灭活苗安全性高，但存在制备成本高、免疫剂量大、无法诱导细胞免疫、免疫效果不理想等缺陷。

随着分子生物学技术的迅猛发展，疫苗的研究已不局限于传统方式，出现了许多基于基因组改造和表达的基因工程疫苗。基因工程疫苗可通过多基因表达提供多种抗原，产生针对多种血清型毒株的细胞和体液免疫应答。随着对IBV免疫机制及免疫相关蛋白研究的逐步深入，最大限度地表达和组合免疫蛋白，诱导高水平的细胞和体液免疫，应成为未来的IB疫苗的研究重点。