吴 俐，汤葆莎，赖谱富，李怡彬，翁敏劼，陈君琛，吕旭聪

（1.福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建 福州 350003；2.福州大学化学学院，福建 福州 350108；3.福州大学食品科学与技术研究所/福建省食品生物技术创新工程技术研究中心，福建 福州 350108）

0 引言

【研究意义】红曲由红曲菌接种于蒸熟摊凉的大米发酵而得[1]，在中国已有千年的食用和药用历史。红曲菌（Monascus），又称为红曲霉，属于真菌界（Eumyeophyta）、子囊菌门（Aseomycota）、真子囊菌纲（Euaseomycetes）、散囊菌目（Eurotiales）、红曲科（Monascaeeae）[1-2]。红曲霉代谢过程中产生红曲色素、莫纳克林 K（MK）、γ-氨基丁酸（GABA）、多糖、麦角固醇等，具降胆固醇、降血压、抗氧化、降血糖等多种药理活性[3]。因此，红曲是优良的功能活性资源。作为红曲主产区，福建省和浙江省代表性红曲中抗氧化资源的研究少见报道，阻碍了后续的针对性开发利用。对红曲功能活动成分及体外抗氧化活性的研究可以为福建省红曲资源的开发利用提供数据支撑。【前人研究进展】近年来，红曲色素的分离鉴定和功能活性研究有了较大的突破。首先，已经鉴定的单一色素成分超过100种[4]；其次，红曲色素的降胆固醇、降血压、抗氧化、降血糖、缓解阿茨海默症等多种药理活性均与抗氧化活性密切相关[5]。MK是胆固醇合成限速酶HMGCoA还原酶的竞争性抑制剂[6]，通过消除自由基及抑制脂质过氧化、抑制炎性因子渗出，较小剂量产生理想的抗炎效果，其抗炎机制与抗氧化活性有关[7-8]。GABA提高肝脏抗氧化酶活性的同时降低自由基和丙二醛含量，抑制高脂诱导肥胖小鼠肝脏氧化应激[9]。红曲发酵酱油的清除DPPH自由基能力与MK、GABA、多酚含量密切相关[10]。红曲霉胞外多糖质量浓度142.3 mg·mL-1，具有较强的清除DPPH自由基能力[11]。麦角甾醇是红曲发酵产生的主要维生素类化合物，也是微生物细胞膜的主要成分之一，具有抗氧化功效[12]。红曲还含有二聚酸、亚油酸、α-亚麻酸等其他抗氧化物质[13]。以上研究结果显示，红曲主要功能活性物质也是潜在的抗氧化资源。【本研究切入点】红曲色素、MK、多糖等主要的功能活性成分对红曲的抗氧化活性具有一定的贡献，但其抗氧化的主要起效成分还有待进一步确定，特别是针对红曲主产区福建省和浙江省代表性红曲的抗氧化功效成分研究还有待深入。【拟解决的关键问题】从福建、浙江两地搜集功能曲、色曲、乌衣红曲和古田红曲等4类红曲代表性样品，分析主要功能活性成分和体外抗氧化活性，将主要功能活性成分与抗氧化活性等指标进行相关分析，筛选抗氧化活性的主要作用成分，为红曲抗氧化资源的开发利用提供科学支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料与试剂 红曲搜集自福建省宁德市、泉州市、龙岩市和福州市和浙江省江山市等10个地区，生产上按照用途或功能活性成分的特点可以分为4类：功能曲（FQ）、色曲（CQ）、乌衣红曲（WQ）和古田红曲（GQ）。每种红曲收集5份资源，共计20份代表性样品。药用的FQ和着色用的CQ的最主要功能活性物质分别为MK和色素。FQ样品的MK含量为0.5%～3.5% ，符合功能红曲MK含量≥0.4%（干重计）的要求；CQ样品的色价为2 000～6 000 U·g-1，符合色曲色价≥1 000 U·g-1（干重）的要求。乌衣红曲和古田红曲均是红曲黄酒酿造曲，二者发酵活性有一定差异[14]。取样的红曲水分含量2.78%～9.43%，均符合标准[15-17]。95%乙醇、无水乙醇、2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐均为分析纯，液相色谱使用的甲醇、乙腈等试剂均为色谱纯。

1.1.2 仪器与设备 BL60S电子天平（德国Sartrius）；GL10MD高速冷冻离心机（湖南湘仪试验仪器开发有限公司）；R205B旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；CLARIO Star多功能酶标仪（德国BMG LABTECH公司）；KQ-600DV数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Waters e2695高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；LC600A高效液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）；MB25水分分析仪[奥豪斯仪器（上海）有限公司制造]；NS810分光测色仪(深圳市三恩池科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 红曲前处理 红曲粉的制备：称量1 kg红曲米，采用高速粉碎机粉碎，过50目筛，收集粉末混合均匀，4 ℃保存备用。

1.2.2 不同红曲主要功能活性成分的测定方法（1）色素的测定方法。红曲色素是混合色素，采用色价表征色素，按照GB 1886.19—2015《食品安全国家标准 食品添加剂 红曲》[15]中色价的检测方法，测定红色素色价E510、黄色素色价E390、橙色素色价E465。色价E (U·g-1)按下式计算：

式中，A——浸泡稀释液的吸光度；100、50——换算系数；m1——称取试样的质量，g；V——吸取乙醇浸泡液的体积，mL。

红曲色素也可以采用色差表征色素。色差测定方法：取1 g红曲粉，置于直径3 cm的透明培养皿中，使粉末均匀散开。开启分光测色仪，以白板校准，测定红曲粉末的色差指标（总色差△E、白/黑差值△L*、红/绿差值△a*、黄/蓝差值△b*）。

（2）莫纳克林K（MK）的测定方法。按照轻工行业标准QB/T 2847—2007《功能性红曲（粉）》[16]中MK的检测方法进行试样处理、酸式MK制备。液相条件：采用Waters e2695高效液相色谱仪，C18色谱柱（ 5 μm×250 mm×4.6 mm）；二极管阵列检测器（DAD），紫外检测器，检测波长238 nm，流动相V（甲醇）∶V（水）∶V（磷酸） = 385∶115∶0.14，流速 1.0 mL·min-1，进样量 20 μL。内酯式和酸式MK标曲的绘制：采用75%乙醇溶液配制内酯式MK标准液，质量浓度分别为0.00、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、300.00 μg·mL-1，每一样品重复进样2次。以内酯式MK标准液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制内酯式洛伐他丁标准曲线y=61 251x- 84 848，R² = 0.979。相同方法绘制酸式洛伐他丁标准曲线y= 71 682x，R² = 0.999。MK (mg·g-1)按下式计算：

式中，h1——样品中内酯式MK峰面积；h2——样品中酸式MK峰面积；h3——标准内酯式MK溶液峰面积；50——试样定容体积，mL；C——标准内酯式洛伐他溶液浓度，mg·mL-1；m——试样称取量，g。

（3）不同红曲γ-氨基丁酸（GABA） 的测定方法。试样处理和柱前衍生化按照QB/T 4587—2013《γ-氨基丁酸》法[18]进行测定。液相条件：Waters e2695高效液相色谱仪，配紫外或蒸发光衍射检测器，A相：0.1 mol·L-1乙酸钠溶液（三乙胺0.22‰，四氢呋喃5‰）。B相：V（0.1 mol·L-1乙酸钠溶液）∶V（乙腈）∶V（甲醇）=1∶2∶2。梯度洗脱。柱温：40 ℃。流速：1.0 mL·min-1。检测波长338 nm。GABA标准曲线：准确吸取0.5 mg·mL-1标准溶液2、4、5、10、12 μL进行色谱分析，标准曲线为：y= 2×107x-1×106，R² = 0.999。GABA (%)按公式计算：

式中，Ai——样品中GABA的峰面积；ms——GABA标准品的质量，g；Vs——GABA标准品的稀释体积，mL；As——GABA标准品的峰面积；m——称取样品的质量，g；V——样品的稀释体积，mL。

（4）不同红曲麦角固醇的测定方法。麦角固醇提取参考文献[19]。液相条件：LC600A高效液相色谱仪，南京科捷分析仪器有限公司。C18柱（5 μm×250 mm×4.6 mm），紫外检测器：282 nm。流动相为V（甲醇）∶V（二氯甲烷）= 75∶25。流速 1.0 mL·min-1。进样量 20 μL。 麦角固醇标准曲线：10、20、30、40、60、80、100 μg·mL-1的麦角固醇标准溶液浓度，麦角固醇浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，标准曲线为y= 2 118x+ 1 634。R² = 0.999。

（5）不同红曲多糖的测定方法。多糖提取：称量1 g红曲粉，置于50 mL离心管，按照1∶10（m/V)加入蒸馏水，450 W超声提取60 min，3 500 r·min-1，离心10 min，取上清液。4倍体积无水乙醇沉淀，离心获得残渣即红曲多糖。多糖蒸馏水复溶，苯酚硫酸法测定[20]。葡萄糖标准曲线及多糖测定：精确量取 40 μg·mL-1D-葡萄糖标准溶液 0.00、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mL分别加到20 mL的具塞试管中，各以蒸馏水补至2.0 mL；加入6%苯酚1.0 mL，摇匀；再加入浓硫酸5 mL，静置10 min，再摇匀；室温放置20 min；于490 nm波长处测定吸光度。葡萄糖微克数为横坐标，吸光度值为纵坐标，标准曲线为：y= 0.006 7x+ 0.087 7，R2= 0.999 3。

1.2.3 不同红曲的体外抗氧化性测定 红曲醇提液的制备：称量10 g红曲粉，按照1∶10（m/V）料液比加入70%乙醇溶液，50 ℃，540 W超声30 min，超声提取3次，合并滤液。30 r·min-1，50 ℃，将滤液旋转真空浓缩至膏状。80 ℃烘干称重。用70%乙醇复溶 0.1 g·mL-1，-20 ℃ 保存。

采用Uv/Vis检测技术，通过铁离子还原力[21]、DPPH自由基清除试验[5]和ABTS自由基清除试验[3]测定红曲醇提液的体外抗氧化活性。

铁离子还原抗氧化能力（Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）为样品700 nm吸光值，吸光值高表示样品的铁原子还原力较强。

DPPH自 由 基 （1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）清除率计算公式如下：

式中：Ai——待测样品与等体积 0.2 mmol·L-1DPPH混合液的吸光度；Ac——0.2 mmol·L-1DPPH溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度；Aj——待测液与等体积无水乙醇混合液的吸光度。

拟合红曲醇提液的浓度与DPPH自由基清除率的线性方程，计算清除一半DPPH自由基的红曲醇提液的浓度，即DPPH自由基半数抑制率（DPPHIC50）。

ABTS自 由 基 [2,2 ′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）， ABTS]清 除 率按以下公式计算：

式中，A0值：取ABTS自由基工作液160 μL加入到96孔板中，加无水乙醇40 μL， 734 nm吸光值为 A0（0.70±0.02）。A值：取（40-x）μL无水乙醇加入到96孔板中，加样品液xμL，再加ABTS自由基溶液160 μL， 734 nm吸光值A。

拟合红曲醇提液的浓度与ABTS自由基清除率的线性方程，计算清除一半ABTS自由基的红曲醇提液的浓度，即ABTS自由基半数抑制率（ABTSIC50）。

1.3 数据分析

测量数据以平均值±标准差表示，组间的方差分析采用t检验。采用SPSS22.0软件对数据进行Spearman相关系数计算。采用SIMCA 14.1软件进行主要功能活性成分和抗氧化指标的关联分析，并绘制载荷图和聚类图。

2 结果与分析

2.1 不同红曲的主要功能活性成分分析

2.1.1 不同红曲的色素含量 4类红曲的橙色价（E465）、黄色价（E390）和红色价（E510）以及总色价E（E465+E390+E510）结果（表1）显示，色曲（CQ）的红色价、黄色价、橙色价显著高于古田红曲（GQ）、功能曲（FQ）和乌衣红曲（WQ），GQ的红色价、黄色价、橙色价显著高于FQ和WQ，FQ的橙色价显著高于WQ。CQ总色价均值3 911.23 U·g-1符合GB 1886.19—2015 中规定的总色价 ≥ 1 000 U·g-1[14]，WQ、FQ和GQ的总色价低于该标准。4类红曲中3种色价的占比相对均衡。

表1 不同红曲的橙色价（E465）、黄色价（E390）和红色价（E510）Table 1 Orange, yellow, and red color value of various Hongqu

从表2可见，以白板为对照，4类红曲（粉）的色差值△E差异非常明显，CQ、GQ、FQ和WQ分别呈现暗红、鲜红、粉红、灰粉色。4类红曲白/黑差△L*为负，说明红曲的白/黑差是偏黑；红/绿差△a*为正，说明4类红曲在红绿轴上偏红；黄/蓝差△b*为正，说明4类红曲在黄蓝轴上偏黄。CQ和GQ的色差值较大，其次是FQ，WQ的色差值最小（乌衣红曲含有黑曲霉，亮度偏暗）。一般色差△E＞2，认为存在肉眼可辨差异，因此凭借色差值可以区分WQ、FQ，但是无法区分GQ和CQ。

表2 不同红曲的色差Table 2 Chromatism of various Hongqu

2.1.2 不同红曲的莫拉可林K（MK） 根据QBT 2847—2007 《功能性红曲米（粉）》规定莫拉可林K（monacolin K ，MK）≥0.40%（以绝干计，即4 mg·g-1）。从表3可见， FQ的MK含量分别为6.98～33.73 mg·g-1，达到行业标准的要求。FQ的MK含量显著高于CQ、WQ和GQ。CQ的MK含量均值0.26 mg·g-1，明显高于WQ和GQ，但低于行业标准。MK包含酸式和内酯式，内酯式MK需要人体内羟基酯酶的参与发挥降胆固醇的作用，所以酸式MK的降胆固醇的作用效果优于内酯式MK。FQ的酸式占比分别为12.88%～27.01%，为后续活性评价提供参考。

表3 不同红曲的莫纳克林K（MK）Table 3 MK contents in various Hongqu

2.1.3 不同红曲的γ-氨基丁酸 （GABA）、麦角固醇、多糖含量 从图1-A可见，不同红曲的GABA显示，WQ的GABA含量0.71 μg·g-1，显著高于GQ、FQ和CQ。GQ、FQ和CQ的GABA含量，分别为0.13、0.24、0.15 μg·g-1，差异不显著。

4类红曲的麦角固醇含量差异较大（图1-B），WQ和 FQ 的麦角固醇含量平均为 472.12、449.65 μg·g-1，显著高于 CQ （247.21 μg·g-1）和 GQ（156.64 μg·g-1）。说明WQ和FQ的真菌生物量比CQ和GQ的更高，培养基质的转化利用更加充分。

4类红曲的多糖含量（图1-C）的结果显示，FQ的多糖含量最高（39.97 mg·g-1），显著高于其他3类红曲； CQ的多糖含量（15.32 mg·g-1）次之，显著高 于 WQ（6.22 mg·g-1）和 GQ（7.29 mg·g-1）； WQ和GQ 多糖含量没有显著差异。

2.2 不同红曲的体外抗氧化活性

不同红曲的1 mg·mL-1乙醇提取物的铁离子还原抗氧化能力（FRAP）测定结果见图2-A。1 mg·mL-1阳性对照维生素C的吸光值为0.918，CQ的铁离子还原力最强，为0.712，显著高于其他3类红曲，WQ和GQ 的吸光值显著高于FQ。说明CQ的还原铁离子的抗氧化能力最强。

4类红曲的醇提取物的DPPH自由基清除能力（DPPHIC50）的测定结果（图2-B），DPPHIC50越小，抗氧化能力越强。CQ的DPPH自由基清除能力最强，DPPHIC50达到0.11 mg·mL-1；其次为FQ和GQ，分别为 0.54 、0.43 mg·mL-1，二者没有显著差异； WQ 的DPPH自由基清除能力最弱，DPPHIC50为 0.88 mg·mL-1。阳性对照维生素 C清除DPPH 自由基的IC50为 0.02 mg·mL-1。

4类红曲的醇提取物的ABTS自由基清除能力（ABTSIC50）的测定结果（图2-C），ABTSIC50越小，抗氧化能力越强。CQ的ABTSIC50为21.72 μg·mL-1，抗氧化能力显著强于其他三者，而FQ、GQ和WQ之间ABTS自由基清除能力没有差异。阳性对照维生素C清除ABTS自由基的IC50为4.94 μg·mL-1。

2.3 不同红曲主要功能活性成分、抗氧化等指标的相关性分析

从表4可见，红/黄/橙色价E510/E390/E465之间具有强相关（r≥ 0.98）， △E与色价极显著相关（r≥0.778）；铁离子还原抗氧化能力FRAP与色价极显著正相关（0.733 ≥r≥ 0.703），但是FRAP与麦角固醇极显著负相关（r= -0.448），与MK、GABA和多糖负相关，说明色素是4类红曲中发挥还原铁离子的抗氧化作用的主要成分。DPPHIC50与色价极显著负相关（-0.880 ≤r≤ -0.896），但是 DPPHIC50和GABA、麦角固醇正相关（r= 0.596、r= 0.412），ABTSIC50与色价极显著负相关（-0.773 ≤ r ≤ -0.758），但ABTSIC50与GABA、麦角固醇正相关（r= 0.319、r= 0.211），DPPHIC50、ABTSIC50分别和 MK、多糖呈弱负相关，说明色素是4类红曲中发挥清除DPPH自由基、ABTS自由基的抗氧化作用的主要成分。这与文献报道红曲黄色素具有较强清除自由基和细胞抗氧化活性是一致的[21]。

表4 不同红曲主要功能活性成分、抗氧化等指标的相关系数Table 4 Correlation coefficients on key functional components and antioxidant indices of various Hongqu

不同红曲主要功能活性成分和抗氧化活性指标关联分析的主成分分析（Bioplot）结果（图3-A）显示：4类红曲分散在不同区域，说明4类红曲的功能活性成分和抗氧化活性有明显的差异。CQ与色素（色价E510、E390、E465和色差△E）和铁离子还原抗氧化能力FRAP之间的距离近，和ABTSIC50、DPPHIC50最远，说明CQ中色素含量最多，CQ的还原铁离子能力和清除ABTS、DPPH自由基的能力最强。FQ与MK、多糖距离最近，说明FQ的MK和多糖含量最大。WQ和GABA、麦角固醇、ABTSIC50、DPPHIC50最近，说明WQ中麦角固醇和GABA的含量最大，同时其清除ABTS、DPPH自由基的抗氧化能力最弱。GQ处于所有指标和样品的最中间，功能活性物质组成和抗氧化与FQ最为接近。层次聚类图（HCA）也显示4类红曲分别聚类，与生物图结果一致（图3-B）。

3 讨论

红曲菌具有丰富的淀粉酶、糖化酶和酯化酶等，通过固态发酵谷物、高粱和玉米等农副产品，能够合成红曲色素、莫纳克林类、γ-氨基丁酸、麦角固醇、多糖等功能活性代谢产物，明显提高农副产品的抗氧化性等功能性价值[22]。红曲菌液体发酵或酿造应用中具有耐受高浓度乳酸和乙醇的特性，这与其代谢产物的抗氧化活性能缓解氧化胁迫密切相关[23]。由于不同菌种在不同发酵条件下会产生复杂的红曲色素混合物，使其色调和色价的表征依据多样化，导致色价检测方法缺乏统一标准，即使是现行国家标准，也尚存矛盾之处：GB 1886.66—2015[24]中以OD476±10nm作为还原型红曲黄色素的黄色价，GB 1886.181—2016[25]中以OD495±10nm作为红色价，黄色价和红色价存在波长交集；GB 1886.19—2015中黄色价OD388nm，符合大多数文献报道天然红曲黄色素波长330～450 nm。天然和还原型红曲黄色素的黄色价检测波长截然不同；总色价OD505nm偏向红色价。因此，综合文献报道和国家标准，本文参照现有文献对4类红曲样品进行规范化测定。GB 1886.19—2015 规定色曲的总色价 ≥ 1 000 U·g-1，DB S35/002—2017规定古田红曲和乌衣红曲的总色价≥ 400 U·g-1[17]，色曲和古田红曲的总色价达标，功能曲的色价没有限定。值得注意的是色差和色价极显著正相关，凭借色差能较好地区分不同红曲，操作简便。色曲主要产品红曲红通过菌种诱变、固定化细胞技术、菌种联合培养和优化培养基等多种途径不断提高色素产量[26]，作为着色剂广泛应用于食品加工领域。MK数据变异度大，是以代表性企业的不同MK 含量的功能红曲产品为试验对象导致的。黄酒抗氧化能力高于白葡萄酒但低于红葡萄酒，是游离氨基酸、蛋白质和GABA的良好来源，其中GABA 含量约为 10 μg·mL-1[27]。乌衣红曲和古田红曲都是黄酒酿造曲，其中乌衣红曲的GABA含量在4类红曲中最高，与其菌群结构多样性密不可分，除红曲霉外，乳酸杆菌和酵母菌同样具有高产GABA能力，通过菌种诱变和培养基优化后产量高达 9.3 g·L-1[28]和 2.6 g·L-1[29]。麦角固醇可以显著降低喂食高脂肪饮食的C57BL/6J小鼠的血清总胆固醇、甘油三酯、和低密度脂蛋白胆固醇的水平[30]。麦角固醇作为真菌细胞膜的重要组成成分，成为固体发酵混合物中真菌生物量的重要表征。乌衣红曲和功能曲中麦角固醇含量（真菌的生物量）比色曲和古田红曲更高，与功能曲由红曲霉较长周期的发酵制成有关，而乌衣红曲具有红曲霉、根曲霉和酵母等复杂真菌构成相关[31]。红曲多糖和改性产品具有一定的抗氧化活性[32]。固态发酵红曲的多糖含量随发酵时间的延长不断积累，30 d达峰值6.14%，30～75 d内基本稳定，随后下降[33]。乌衣红曲和古田红曲发酵周期为5～7 d，色曲9～14 d，功能曲38～45 d，多糖含量随着发酵周期阶梯式上升，符合文献报道的多糖变化规律。 GABA、多糖和麦角甾醇可能是抗氧化活性的潜在贡献者。屈炯等测定了红曲红色素组分2清除羟基自由基（•OH）、二苯代苦味肼自由基（DPPH）和超氧阴离子自由基（•O2-）的能力，分别为31.17%、63.53%和33.89%，抗氧化能力优于相同浓度维生素C溶液[5]。

本研究发现4类红曲醇提液的铁离子还原能力、清除DPPH、ABTS自由基的抗氧化能力与色素含量极显著相关，而抗氧化能力与MK、GABA和多糖含量等指标无显著正相关，试验结果与文献报道相一致。 色曲、功能曲和酿造曲（乌衣红曲和古田红曲）因为用途不同，相应地生产菌种和制作工艺也不同，终产品的色素、MK等主要功能活性及其物质组成各具特色。色曲以突出的色素组成与抗氧化活性为优势，是红曲抗氧化优良资源。功能曲以突出的MK、多糖含量为特点，作为公认的降脂药物，也可作为调节免疫、糖脂代谢的研究材料。而乌衣红曲的麦角固醇、GABA 含量最多，提示乌衣红曲作酿造用途外，还可能是降血压活性的良好材料。古田红曲的主要功能活性物质的含量介于其他3类红曲中间，可以作为其他3类红曲特定生物活性研究的参考材料。

4 结论

通过比较分析曲功能曲（FQ）、色曲（CQ）、乌衣红曲（WQ）和古田红曲（GQ）的色价、MK、GABA、麦角固醇、多糖等主要功能活性成分和体外抗氧化活性，发现CQ的色价和抗氧化活性显著高于FQ、WQ和GQ，且色价和抗氧化活性极显著相关，说明红曲色素是红曲抗氧化活性的功效成分。值得注意的是4类红曲具有不同的功能活性成分特征：CQ的色素含量最高，FQ的MK和多糖含量最高，WQ的GABA、麦角固醇含量最高，以上功能活性成分的特点可为未来抗氧化等生物活性研究提供借鉴和参考。