林 静，张 扬，林建新，卢和顶，陈山虎，廖长见

（福建省农业科学院作物研究所/福建省特色旱作物品种选育工程技术研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意义】玉米是我国最大的粮、饲兼用作物，随着人民生活水平的提高，玉米已经不单单作为粮食和饲料，多用途玉米品种的培育日益受到育种家的重视[1]。甜玉米（Zea maysL.saccharataSturt）又称水果、蔬菜玉米，是玉米属（Zea maysL.）的一个亚种[2]。由于甜玉米可溶性糖含量较高，甜味浓郁，并携带玉米特有的香味，深受消费者喜欢。此外，甜玉米还富含多种维生素、氨基酸、矿物质及多种微量元素易于人体吸收，因此具有很高的营养价值[3]。我国消费群体基数很大，对甜玉米的需求量巨大，然而我国甜玉米的育种、栽培和加工、贮藏产业起步较晚，产业成熟度不高，因此甜玉米上游产业链，特别是新品种的培育等工作亟待加强[4-6]。【前人研究进展】从品质上甜玉米可分为普甜、超甜和加强型甜玉米[7]，其形成的机制主要是普通玉米籽粒中一个或几个基因发生突变，造成淀粉合成受阻，从而导致可溶性糖（如蔗糖）的积累。相关基因有sh1、sh2、su1、bt1、bt2、ae1等[8-9]。这些基因表达的大多是玉米籽粒淀粉合成途径中涉及到的酶，包括蔗糖合酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶和颗粒结核型淀粉合成酶。其中蔗糖合酶（Sucrose synthase，Sus）在植物中可形成同源四聚体，主要负责催化蔗糖水解[10-14]，是蔗糖代谢的关键酶之一，也是蔗糖合成淀粉途径中的第一个关键酶，负责调控植物不同组织中细胞壁成分或淀粉合成，与植物生长发育过程密切相关。因此，玉米中蔗糖合酶的功能缺失突变体有利于糖分的积累，编码蔗糖合酶的基因包括Sh1,Sus1和Sus2（Sus3）等[15-17]。Zhu 等[18]研究发现，糖类含量（蔗糖）与果实品质密切相关，而Sus活性能直接影响果实中蔗糖的积累水平。赵云等[19]研究发现，开花后高温处理能抑制小麦籽粒的Sus活性，从而影响籽粒中淀粉的累积。【本研究切入点】玉米是一个具有高异交率的作物，杂种优势在玉米育种被广泛的应用。传统杂交甜玉米育种流程包括亲本筛选，配合力测定，田间鉴定及采后品鉴等过程，整个育种周期长且繁琐。尽管一些甜玉米调控基因被广泛鉴定和克隆，但水溶性糖分含量在杂交后代中超亲遗传作用机理的研究鲜有报到。闽双色6号是福建省农业科学院作物研究所选育的超甜杂交玉米品种，其水溶性糖和还原糖含量都优于亲本，在糖代谢途径上存在超亲优势。【拟解决的关键问题】本研究在双亲闽甜系67和闽甜系146的基因型sh2的基础上，在基因组和转录组水平上对编码蔗糖合酶的基因进行分析，探索闽双色6号甜度超亲遗传的部分机制，旨在为今后超甜玉米的培育提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为福建省农业科学院作物研究所选育的杂交品种闽双色6号及其杂交双亲闽甜系67（基因型sh2）和闽甜系146（基因型sh2），均由本课题组在寿山基地进行繁殖和保存。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米蔗糖合酶基因的进化树和结构分析 在Ensembl网站下载玉米参考基因组B73的注释信息文件和蛋白序列（网站地址：http://plants.ensembl.org/Zea_mays/Info/Index），根据注释文件信息筛选蔗糖合酶基因，利用TBtool软件[20]从B73的蛋白序列文件下载对应蛋白序列。如果该基因存在多个转录本，则下载最长转录本对应的蛋白序列进行进化分析。蛋白序列进化分析在基迪奥在线分析网站（https://www.omicshare.com/tools/）进行，将运行后获得的result.nwk提交至iTOL网站（https://itol.embl.de/）进行图形化处理。玉米蔗糖合酶基因结构信息使用TBtool软件进行绘制。

1.2.2 玉米蔗糖合酶基因的表达分析 蔗糖合酶基因在不同品系间的表达分析使用转录组的方法。RNA文库制备制备如下，利用带有Oligo（dT）的磁珠对mRNA进行富集，使用超声波把mRNA打断。使用M-MuLV逆转录酶体以片段化的mRNA为模版合成cDNA第一条链，反转录产物使用RNaseH降解RNA链。使用DNA polymerase I酶合成双链cDNA，纯化后加接头，用AMPure XP beads筛选200 bp左右的cDNA，进行PCR扩增，产物再次使用AMPure XP beads纯化形成最终文库。文库检测合格后在Novaseq 6 000测序仪上进行。获得原始数据后在诺禾致源公司进行流程化分析，获得FPKM表达值。

1.2.3 玉米蔗糖合酶的基因序列差异分析 闽甜系67和闽甜系146的玉米蔗糖合酶基因差异分析采用二代测序的方式。文库制备简要描述如下样本基因组DNA提取使用 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法[21]， DNA质 量 使 用 Nano-drop（Thermo Fisher Scientific, Waltham，MA）进行检测。合格的DNA利用酶随机打断，末端修复后加A尾，使用 NEB Next®MLtra™ DNA Library Prep Kit 库（NEB，USA）添加Illumina测序接头，对300~400 bp的DNA片段进行PCR扩增富集，检测合格后在Nova-seq 6000测序仪上进行。用 FASTP 软件对的原始数据进行过滤，使用BWA软件将Raw data比对到参考玉米基因组B73上，比对参数为-k 32 -M；比对完之后结果使用软件Picard标记重复reads统计标记后的reads深度及覆盖度。使用变异检测软件 GATK进行群体 SNP和Indel检测，使用ANNOVAR进行功能注释，提取玉米蔗糖合酶的基因序列之间SNP和Indel差异。

2 结果与分析

2.1 玉米蔗糖合酶基因的家族进化分析

对参考基因组B73进行全基因组筛选后共发现18个注释的玉米蔗糖合酶基因，对这些基因进行系统进化分析，结果显示（图1），这18个基因可以明显分为Group I～III亚家族，分别包含1、6和11个基因。其中已报道蔗糖合酶基因Sh1、Sus1和Sus2/3均属于Group II亚家族，且它们的蛋白序列很相近，暗示3个基因功能相似，存在功能冗余或累加效应。此外，进化树结果显示基因Zm0001d029087位于Sh1和Sus2/3之间，与3个已报道基因进化关系密切，暗示该基因在蔗糖合成或降解途径中具有类似功能。

2.2 玉米蔗糖合酶家族基因的结构变异分析

对玉米蔗糖合酶家族基因的编码区结构进行分析（图2），发现该家族基因的外显子数目为3～15个，其中Sh1基因外显子最多，为15个，Zm00001d020527、Zm00001d014119和Zm00001d050151仅3个，表明蔗糖合酶家族基因在进化过程中经历过剧烈的外显子增加或缺失变异。此外，3个已报道基因Sh1、Sus1和Sus2/3的外显子分别为15、14和10个，结构相对复杂，暗示蔗糖降解过程需要基因的多个结构域协同发挥作用。Zm00001d002655和Zm00001d035393等多个基因的外显子为5个左右，且结构一致或相似，表明它们之间功能冗余或者相似，但是否在籽粒蔗糖降解中起作用仍需进一步验证。

进一步分析这些基因在甜玉米中的潜在作用，利用重测序的方法对闽甜系67和闽甜系146的基因型与普通玉米品种B73的基因型进行对比分析。结果显示（表1）在双亲与B73间共发现40个有效突变位点，分布在11个基因上，主要为非同义突变（Nonsynonymous）和移码突变（Frameshift）2种突变类型，分别有29、9个突变位点，非移码缺失突变（No-frameshift）、终止子缺失（Stoploss）和终止子获得（Stopgain）突变各1个。其中Sh1（Zm00001d045042）基因在闽甜系67中为正常型，在闽甜系146中为突变型；闽甜系67的Sus1（Zm00001d047253）基因与B73相比存在2个移码突变，推测为功能缺失型，闽甜系146与B73的Sus1基因存在2个非同义突变。此外，Sus2/3基因在双亲间基因型一致，与B73相比均为突变型。综上结果表明，已报道的3个蔗糖合酶基因在 闽甜系67和闽甜系146的基因型分别为Sh1sus1sus2/3和sh1Sus1sus2/3，部分蔗糖合酶基因功能的缺失突变构成甜玉米闽甜系67和闽甜系146的遗传基础，同时为闽双色6号的超甜特性提供了遗传物质基础。此外，两亲本中Zm00001d029087的基因型与B73一致，推测均为正常型，表明其可能在维持玉米正常代谢过程中起着关键作用。

表1 双亲与B73的基因型对比分析Table 1 Comparison on genotypes between parents and B73

2.3 玉米蔗糖合酶基因家族在籽粒中的表达分析

基因型差异是遗传变异的基础，是否发挥功能仍需在基因表达层面上进行分析，因此为进一步确认蔗糖合酶基因家族在籽粒中的作用，对这些基因在3个品系籽粒中的表达进行分析，结果显示（图3），18个基因中有4个基因在籽粒中表达，分别是Sh1、Sus1、Sus2/3和Zm0001d029087，表明蔗糖合酶基因家族在籽粒糖降解途径中可能由这4个基因发挥功能。此外，结果显示，Sh1和Sus1基因、Sus2/3与Zm0001d029087基因表达模式均相近，提示Zm0001d029087与Sus2/3在 功 能 上 类 似，Zm0001d029087是一个新的影响甜玉米甜度的基因。此外，从表达量上分析，Sh1的表达量在3个材料中均远远高于Sus1、Sus2/3和Zm0001d029087，提示Sh1在蔗糖降解过程中起主要作用。综上结果推测闽双色6号及其双亲的甜质特性主要由Sh1、Sus1，Sus2/3和Zm0001d029087调控，Zm0001d029087在糖代谢中的调控功能需要进一步验证。

2.4 玉米蔗糖合酶家族主要基因的表达差异分析

进一步分析超甜玉米闽双色6号形成中的潜在分子机制，对闽双色6号及其亲本籽粒中的蔗糖合酶基因表达模式进行分析。结果显示（图4-A）Sh1的表达在闽双色6号中显著高于双亲，在双亲间的表达无显著差异；闽双色6号的Su1基因表达量显著低于闽甜系146，高于闽甜系67（图4-B）；此外，Sus2/3和Zm0001d029087基因在闽双色6号中的表达显著低于其在双亲中的表达（图4-C、D）。闽双色6号中4个主要蔗糖合酶基因的表达与双亲间存在显著差异，其中Sus1、Sus2/3和Zm0001d029087在闽双色6号籽粒中表达量较低，提示它们有利于籽粒中蔗糖的积累。此外，Sh1在闽双色6号中表达量最高，但其基因型为Sh1/sh1杂合类型，sh1属于缺陷基因型，编码的酶无蔗糖降解活性，理论上Sh1/sh1基因型的表达产物蔗糖合酶中有一半无活性，即sh1基因的表达属于无效表达。综上结果，从整体表达量上分析，闽双色6号4个基因的有效表达量比双亲显著降低，从而比亲本更有利于蔗糖的积累。

3 讨论

蔗糖合酶是植物中广泛存在的一种糖基转移酶[22]，能够催化蔗糖的分解及合成，是蔗糖进入各种代谢途径所必需的关键酶之一[23]。已知蔗糖合酶在淀粉合成、植株抗逆和植株生长等方面起着重要的作用[24]。在自然界中，大部分基因突变对植物的生存是不利的，例如蔗糖合酶基因突变直接影响其合成功能，进一步影响植株正常的生长发育。在植物进化过程中，为了应对不利情况的发生或者减轻突变后引起的不利影响，植物基因组中往往存在多个功能类似的基因，这些同类基因功能互补或功能累加。比如玉米中已报道蔗糖合酶Sh1和Sus1，单个基因突变形成甜玉米，多个基因突变则可能形成超甜玉米，说明基因间存在功能累加效应。此外，在本试验构建的后代群体里发现，即使已报道的3个蔗糖合酶基因均发生突变，籽粒中仍会有淀粉形成，说明除了这3个基因外，仍存在未知基因行使蔗糖合酶类似的功能。本研究以B73的全序列为参考，在全基因组范围内进行比对分析，发现同类基因有18个，其中Sh1,Sus1和Sus2/3在进化树上分类非常相近，说明3者功能相同或相似，这与已报道结果一致[25]。Zm0001d029087与Sh1,Sus1和Sus2/3均进化关系密切，暗示着它们功能相同或类似。本研究中基因表达分析显示，18个基因中只有Zm0001d029087,Sh1,Sus1和Sus2/3在籽粒中有表达，且Zm0001d029087与Sus2/3表达模式相近，暗示Zm0001d029087在籽粒中具有蔗糖合酶的功能。

作物杂种优势是指两个亲本产生的F1后代在生活力、生长势、抗病性、产量及品质等方面优于双亲的现象。杂种优势在水稻和玉米等作物中均有广泛应用，利用方式主要以杂交种为主，目前我国现有甜玉米品种基本上均属于杂交种，但玉米杂种优势的相关遗传机理仍不明确。本研究中闽双色6号水溶性总含糖量表现出超亲优势。为进一步探究这种优势的机理，首先对其双亲基因型进行鉴定，发现双亲种在已报道的3个蔗糖合酶基因Sh1、Sus1和Sus2/3中均有2个基因发生突变，说明这些突变基因是甜玉米形成的遗传基础。此外，闽双色6号是杂交种，其Sh1和Sus1的基因型均为杂合类型。表达分析发现，闽双色6号的Sh1基因表达量显著高于双亲，考虑到其中一部分是无功能的sh1类型，不能正确反映表达量与甜度间的相关性，后续需要分别对两种类型Sh1的表达量进行定量和区分。无功能基因表达或翻译后，可能会与正常基因型产生竞争，从而抑制正常基因的表达或功能发挥。此外，闽双色6号Sus1的表达显著低于亲本闽甜系146中正常基因型Sus1的表达，说明单从Sus1基因的表达上分析，闽双色6号的基因型有利于糖分的积累。

4 结论

本研究以闽双色6号及其双亲为研究材料，通过重测序、转录组及生信分析对蔗糖合酶基因家族进行遗传和表达分析，解析杂种优势在超甜玉米形成中的遗传机理和基础。研究结果发现了1个新的蔗糖合酶基因Zm0001d029087，该基因可能参与蔗糖降解过程；此外，超甜玉米闽双色6号更甜的特性主要是由于Sh1、Sus1、Sus2/3和Zm0001d029087的表达显著降低导致蔗糖的积累。研究结果为杂种优势在超甜玉米的培育和利用提供了实例证据，并初步解析了相关形成机理。