王 健，张海欧，杨晨曦，李 娟*

（1.自然资源部退化及未利用土地整治重点实验室，陕西 西安 710075；2.陕西地建土地工程技术研究院有限责任公司，陕西 西安 710075）

0 引言

【研究意义】自20世纪中叶以来，化石燃料的大量燃烧、化肥的过量使用以及过度放牧等人类活动导致大气中的活性氮氧化物含量激增，大气氮素沉降也呈迅猛增加的趋势[1]。有研究表明，2010年我国华北平原部分经济发达地区氮沉降速率已接近30 kg·hm-2·a-1[2]。人为干扰下的大气氮素沉降已成为全球氮素生物化学循环的一个重要组成部分，大气氮沉降速率的急剧增加将严重影响生态系统的生产力和稳定性[3]。由于自然生态系统生产力和生物多样性对外源氮的敏感性，氮沉降对植物的影响受到越来越多学者的关注[4-6]。丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）真菌是土壤里广泛分布的一类有益微生物，能与绝大多数的陆生植物形成菌根互惠共生体[7]。AM真菌通过其密集的根外菌丝网络帮助宿主植物汲取土壤中的水分和无机营养，换取宿主植物光合作用产物用于自身的生长繁殖。预测大气氮沉降速率增加的背景下，研究AM真菌对作物，尤其是对庄稼作物的影响，对于农业生态系统的施肥管理具有重要的理论和实践意义。【前人研究进展】研究表明，AM真菌能显著提高宿主植物对氮、磷的吸收，进而提高其生物量[8]。此外，氮沉降引起的土壤氮含量增加会直接影响AM真菌的多样性和功能，进而影响植物的生长[9]。Johnson等[10]发现在氮受限制的土壤环境下，氮含量的增加有利于菌根与植物形成共生，而Jiang等[11]的研究结果则表明在高寒草甸生态系统中随着氮含量的增加，AM真菌与植物的关系逐渐由共生变为了寄生。由此可见，AM真菌在不同氮环境下或不同生态系统中，形成菌根的能力不同，对植物生长效应也不同。张旭红等[12]研究证明，AM真菌对宿主植物的有效性决定了他们之间的相互选择性。【本研究切入点】先前关于不同施氮背景下的宿主植物对AM真菌的响应研究主要集中于高寒草甸或干旱半干旱性草原，且供试宿主也多以草本植物为主。一年生草本植物高粱（Sorghum hicolorL.Mocrnch）是关中平原地区常见的粮食作物，又因其侵染率高、生物量大、根系发达、生长速度快，常被作为AM真菌功能研究的模式宿主之一。当前我国关中平原地区高粱复种指数高、氮肥施用量大且利用效率低。关中平原地区高粱氮肥减施增效技术的创新应用对我国粗粮生产具有典型性和引领性。【拟解决的关键问题】以高粱为研究对象，通过温室盆栽模拟试验探究AM真菌和氮添加对高粱生物量及氮磷吸收的影响，旨在为全球气候变化背景下AM真菌生理生态学的研究提供一定的科学依据，为我国高粱的高产种植以及微生物肥料的制备提供实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种为摩西球囊霉（Glomus mosseae），以高粱为宿主植物扩繁得到，每克菌剂含有110个孢子，包括植物根断、菌丝等。菌种来自兰州大学细胞活动与逆境适应教育部重点实验室。供试高粱品种为京杂抗四杂交高粱（Sorghum hicolorL.Mocrnch），来自陕西省农业科学院。供试盆栽基质为河沙与沸石混合物[V（河沙）∶V（沸石）=1∶1]，沸石和河沙购自北票市天翊沸石矿业有限公司，河沙粒径1 cm，沸石粒径2 cm。洗净后，混合均匀，121 °C灭活2 h，隔天再灭活1次备用。

1.2 试验设计

试验采用完全随机设计，设置2个接种处理和4个施氮处理。2个接种处理为接种AM真菌菌剂（+AMF）和接种灭活AM菌剂（-AMF）；4个施氮水平（以NH4NO3形式添加）分别为0、200、400、500 mg·kg-1，相当于 0、10、20、30 kg·hm-2·a-1氮沉降水平，分别用N0、N1、N2和N3表示；试验共8个处理，每个处理6盆，总计48盆。

1.3 试验方法

试验于2020年5月15日至9月15日在陕西地建土地工程技术研究院温室内进行。高粱种子用10%的NaClO表面消毒后，于无菌沙中催芽。待种子出芽后，移苗于培养盆（直径37.5 cm×高度34.5 cm）内（基质约10 kg·盆-1），施以hoagland营养液维持植物正常生长，每两周一次，一次200 mL。2周后，每盆定苗5株幼苗，并在+AMF处理组幼苗根系穴施AM菌剂15 g·盆-1，在-AMF处理组幼苗根系穴施灭活AM菌剂15 g·盆-1。将定量的NH4NO3溶于水中，分别于第4周、第6周、第8周以及第12周加入不同施氮处理盆中。温室光强为120 μmol·m-2·s-1，昼夜交替时间为15 h/9 h，昼夜交替温差为23 ℃/16 ℃，生长周期为4个月，每隔一周随机移动花盆的位置[13]。待植物生活史完成后，分别收集植物地上茎叶和地下根系，取部分鲜细根系用于侵染率的测定，剩余样品用于生物量的测定，烘干的植物组织粉碎后用于氮磷含量测定。

1.4 测定指标方法

1.4.1 菌根侵染率 取鲜根样1 g左右装入试管中，加入10% KOH溶液没过根样，于水浴锅（70～80 ℃）中碱化处理15~30 min，自来水冲洗3遍；加入2%HCL溶液没过根样于水浴锅中酸化处理30 min，自来水冲洗3遍；加入0.05% 台盼蓝[V（乳酸）∶V（甘油）∶V（水 ）=1∶1∶1]染 色 10 min， 自 来 水 洗 3遍 ；染色后的根样剪成1 cm左右的根断，均匀地铺在涂有PVLG的载玻片上，盖上盖玻片，小心压片至皮层被压开。制备好的装片置于显微镜下（200×）观察并计数[14]。

式中，A为每个样品中观察到的有丛枝结构的视野数；V为每个样品中观察到的有泡囊结构的视野数；N为每个样品中没观察到任何菌根侵染的视野数；T为每个样品中观察的总视野数。

1.4.2 生物量及氮磷含量测定 将高粱收获后的地上部分、洗净后的地下部分分别装信封后，于恒温干燥箱（60 ℃）中烘干48 h至恒重，称其生物量。烘干后的植物组织经球磨仪粉碎，过100目筛，制成供试样品。取0.2 g供试样品，精准置于消煮管底部，加 1 g催化剂 [m（K2SO4）∶m（CuSO4）∶m（硒粉） = 100∶10∶1]，加入 5 mL浓硫酸静置碳化 30 min，于消煮炉420 ℃消煮约40 min，直至消煮液呈现透明的青绿色。待冷却后，将消煮液转移到容量瓶内，用蒸馏水定容至50 mL，用流动注射分析仪测定植物组织氮磷含量（QuikChem 8500）[15]。

1.5 菌根效应计算

计算菌根生长效应（Mycorrhizal growth response,MGR）、菌根氮吸收效应（Mycorrhizal N-uptake response, MNR）和菌根磷吸收效应（Mycorrhizal P-uptake response，MPR），评估不同氮梯度下AM真菌对植物的影响作用[16]，下面用MGR为例来进行说明。

其中，NMmean代表每一个氮水平下-AMF处理组高粱生物量的平均值，AM代表每一个氮水平下+AMF处理组高粱的总生物量。同样地，MNR和MPR也按公式（4）来计算。

1.6 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2013软件进行数据整理，原始数据经检验符合正态分布后进行下一步数据分析，由R语言（R version 3.3.2）进行统计分析和图表绘制。施氮和接种AM真菌处理对侵染率变量、植物生物量以及植物组织氮磷含量的影响利用双因素方差分析进行分析。采用Duncan多重检验比较不同处理下各因变量之间的差异（P≤0.05），采用T-test比较各因变量在+AMF处理和-AMF处理之间的差异（P≤0.05）。此外，利用线性回归分析不同氮水平下菌根效应的变化规律。

2 结果与分析

2.1 氮添加及接种AM真菌对高粱菌根侵染率的影响

由表1可以看出，摩西球囊霉可与高粱宿主形成良好的共生。不接种AM真菌处理（-AMF）组的高粱根系均没有AM真菌侵染；而接种AM真菌（+AMF）显著促进了高粱根系的菌根侵染率（P＜0.001）、丛枝侵染率（P＜0.001）和泡囊侵染率（P＜0.001）。此外，菌根侵染率（P＜0.001）和泡囊侵染率（P＜0.001）受氮添加影响显著，表明在不同氮水平处理下，AM真菌对高粱的侵染能力存在明显差异；随着氮施肥梯度增加，菌根侵染率和泡囊侵染率随之增加，高氮水平可以抑制AM真菌对宿主的侵染。

表1 不同处理下高粱菌根侵染状况Table 1 AM fungi colonization on inoculated sorghum plants grown on soil with varied N deposition

2.2 氮添加及接种AM真菌对高粱生物量及根冠比的影响

由图1可以看出，施氮显著促进了高粱地上生物量（P＜0.001）和总生物量（P＜0.001），降低了高粱根冠比（P＜0.001），但对地下生物量没有显著影响（P＞0.05）。地上生物量和总生物量随着氮肥施用量的增加而增加，根冠比则随着氮肥施用量的增加而降低。接种AM真菌对高梁地上生物量、地下生物量、总生物量以及根冠比在全部水平下无显著影响（P＞0.05），表明在各个氮处理水平下接种AM真菌对高粱的生物量影响不大。在未施氮处理（N0）组，接种AM真菌显著提高了高粱的地上生物量和总生物量（P＜0.05）；在高水平氮添加下（N3），接种AM真菌显著抑制了高粱的地上生物量和总生物量（P＜0.05）；在N2和N3处理下，接种AM真菌显著增加了高粱的根冠比（P＜0.05）。此外，由图1可以看出，接种AM真菌和氮添加处理对高粱的地上生物量（P＜0.001）、地下生物量（P＜0.05）、总生物量（P＜0.001）以及高粱根冠比（P＜0.05）存在显著的交互作用。

2.3 氮添加及接种AM真菌对高粱氮磷吸收的影响

双因素方差分析结果表明施氮显著增加了高粱植株的全氮含量（P＜0.001），接种AM真菌对高粱植物的全氮含量无显著差异（P＞0.05），施氮和接种对高粱组织的全氮含量存在显著交互作用（P＜0.001）。在未施氮处理组接种AM真菌显著增加了高粱植株的全氮含量（P＜0.05），而在高水平氮添加下（N2和N3），接种AM真菌显著降低了高粱植株的全氮含量（P＜0.05）（图2-a）。由图2-b可以看出，高粱组织的全磷含量（P＜0.05）受氮添加处理的影响达到了显著水平，而受AM真菌接种的影响较弱，此外，施氮和接种AM真菌对高粱组织的全磷含量存在显著交互作用（P＜0.001），在未施氮处理下，接种AM真菌显著促进了高粱植株的全磷含量（P＜0.05），而在高水平氮添加下（N3），接种AM真菌对植株全磷含量则表现出显著的抑制作用（P＜0.05）。施氮显著促进了高粱植株的氮磷比（P＜0.001），接种AM真菌对高粱植株的氮磷比在各氮水平梯度下无显著影响（P＞0.05），但在未施肥处理组，接种AM真菌显著提高了高粱的氮磷比；接种AM真菌和氮添加对高粱的氮磷比的影响也不存在显著的交互作用（P＞0.05）（图2-c）。

2.4 氮添加及接种AM真菌对高粱生长的交互效应

由图3-a可知，施氮显著影响了高粱的菌根生长效应，在N0和N3处理组，AM真菌对高粱植株的促生效应MGR的影响达显著水平（P＜0.05），菌根生长效应随氮施肥梯度的增加而逐渐降低，呈线性关系（R2= 0.81，P＜0.001）。菌根氮吸收效应（MNR）（R2= 0.93，P＜0.001）和菌根磷吸收效应（MPR）（R2= 0.88，P＜0.001）和氮添加梯度呈线性关系，均随氮添加浓度的增加而降低，且在N0、N2和N3均达到显著水平。

3 讨论与结论

菌根侵染率是AM真菌与宿主植物建立共生成功与否的重要标志，并在一定程度上决定着宿主植物的生长和抗逆能力[17]。泡囊和丛枝是AM真菌的根内菌丝特化的结构，其数量决定着菌根共生体内物质交换的频率和强度[18]。菌根侵染率既受宿主植物限制，也受土壤速效氮、磷含量制约[19]。目前，土壤速效磷含量对菌根侵染率的影响已被深入研究[20-21]，相对而言，氮添加处理对菌根侵染率的影响研究较少。已有研究结果表明，土壤中速效氮含量过高会降低AM真菌对宿主植物的侵染[22]，而在氮素缺乏的地区，施氮则有利于AM真菌对宿主植物的侵染[23]。本研究中，在未施氮处理组，AM真菌的菌根侵染率和泡囊侵染率均最高，且随着氮水平的不断增加，AM真菌的菌根侵染率和泡囊侵染率逐渐降低，Jiang等[11]在模拟氮沉降对青藏高原优势种垂穗披碱草的生长效应时，也发现氮添加逐渐降低了AM真菌的菌根侵染率。张彩丽[24]从超微结构上得出，氮添加对植物根系造成伤害，导致细胞线粒体肿胀、细胞质分解等现象。此外，本研究中发现丛枝受氮添加的影响不大，这可能和丛枝的特性有关。不同于泡囊和菌丝，丛枝在植物根系皮层细胞内的寿命较短，一般新形成的丛枝1~2周就会被植物根系细胞的内分泌酶消化掉，目前理论尚不能解释为什么丛枝的寿命如此之短。

氮、磷是植物生长不可或缺的营养元素，参与了植物体内许多重要化合物的组成及代谢途径[25]。前人的研究表明，接种AM真菌可以促进宿主植物对土壤氮、磷的吸收，尤其在土壤养分匮乏的地区[26-28]。本研究中在未施肥处理组（N0）中，接种AM真菌显著提高了高粱的地上生物量及组织氮、磷含量，这与徐如玉等[27]的研究一致。AM真菌对宿主植物的促生作用主要得益于AM真菌密集的根外菌丝和无隔的菌丝内壁。通过AM真菌菌丝的磷转运要比通过植物根系的磷转运效率高10倍左右，植物体内约90%的磷和25%的氮是通过AM真菌的菌丝获得[29]；此外，AM真菌提高植物营养吸收的原因还在于其土壤里密集的根外菌丝，尤其土壤中的速效磷容易受土壤胶体吸附，扩散系数低，随着土壤中植物根系对磷的吸收，很快就会形成一个磷匮乏区，而AM真菌的根外菌丝网可以达到植物根系到达不了的地方，扩大了植物根系的吸收面积，大大增加了植物对磷的吸收[30]。

AM真菌对宿主植物的促生效应与土壤环境条件密切相关。在一定土壤养分范围内，菌根的促生效应随土壤养分的减少而增强，原因在于土壤养分较低时，植物生长受限，光合作用产物向根系及AM真菌分配减少，此时适当施肥便能增加AM真菌侵染，从而增加宿主植物对土壤速效养分的吸收，促进其生长发育，大部分的研究证明了这一点[10,31-32]。此外，AM真菌和土壤养分在促进植物生长方面存在交互作用，一方面，植物的生长需要充足的氮源；另一方面，过量的氮素又会抑制AM真菌和宿主植物的共生，进而影响菌根的有益效应[33]。本研究分析高粱的生物量及组织氮磷含量，发现随着氮添加量的增加，菌根对植物的有益效应由正效应（共生关系）逐渐变为负效应（寄生关系），这一点和Jiang等[11]的研究结果一致。主要是由于高水平氮添加情况下，植物通过根系可以吸收氮素满足植物生长需求，而不需要额外负担真菌的营养分配，高氮水平下的低菌根侵染率可以很好地说明这一点。本试验表明，在低水平氮添加下，接种AM真菌可以提高高粱的氮磷含量及生物量，而在高氮条件下，接种AM真菌高粱组织氮磷含量及生物量不升反降。因此，要充分发挥AM真菌的菌根效应，需首先了解当地的土壤养分条件，尤其在全球氮沉降背景加剧的情况下。此外，氮沉降导致高粱生物量降低，一定程度上也是因为高氮水平下，AM真菌和宿主植物处于一种寄生关系，AM真菌在不需要消耗能量的情况下，参与宿主植物的光合产物分配，最后以根外菌丝、孢子及其次级代谢产物（球囊霉素）的形式存在。研究表明AM真菌孢子以及球囊霉素是土壤碳库的重要组成部分[34]，AM真菌在土壤高氮水平下，一定程度上减缓了土壤碳的释放。

终上所述，接种AM真菌显著增加了高粱的菌根侵染率，随着氮浓度的增加，高粱菌根侵染率和泡囊侵染率逐渐降低。本研究发现接种AM真菌和模拟氮沉降对高粱的菌根生长效应（MGR）、菌根氮吸收效应（MNR）及菌根磷吸收效应（MPR）存在显著的交互效应。未施氮处理（N0）时，接种AM真菌显著促进了高粱的MGR、MNR以及MPR；但随着氮梯度的增加，高粱的MGR、MNR以及MPR逐渐由正效应转为负效应，当模拟氮沉降浓度达到400 mg·kg-1（N2）时，接种AM真菌显著抑制了高粱的MNR以及MPR；当模拟氮沉降浓度继续增加到 500 mg·kg-1（N3）时，高粱的 MGR、MNR以及MPR均受AM真菌抑制。本试验选用的是单一的AM菌种，不同的AM菌种，尤其是混合菌种对氮的耐受性不尽一致，且本研究所采用的盆栽试验，与外界大田所处的氮沉降仍会有一定差异，后期需进一步研究。