王 淘，杨 澄，闫亚娜，王雨潇，李瑞民

（赣南师范大学生命科学学院，江西 赣州 341000）

0 引言

【研究意义】柑橘（Citrusspp.）是世界上最重要的果树作物之一，也是我国重要的经济果树作物。柑橘病虫害严重制约柑橘产业的健康发展。目前，在140个柑橘生产国中，有51个国家存在柑橘黄龙病（CitrusHuanglongbing）[1]。柑橘黄龙病是柑橘生产上一种毁灭性的病害，由韧皮部杆菌引起，韧皮部杆菌侵染寄主过程中激发柑橘系统的免疫反应，包括活性氧的产生、胼胝质积累以及免疫相关基因的诱导表达[2]。硫氧还蛋白（Thioredoxin）在清除活性氧代谢中发挥重要作用，是一类广泛分布于细胞内的小分子蛋白，而对硫功能的解析对于了解柑橘黄龙病的发生发展以及寄主对韧皮部杆菌的应答反应具有重要意义。【前人研究进展】硫氧还蛋白分为6种类型，分别为f、h、m、o、x和y。其中f、m、x和y型硫氧还蛋白在叶绿体中发挥功能，用于稳定光合电子传递过程中的氧化还原状态。o型硫氧还蛋白定位于线粒体，其作用为清除线粒体中产生的活性氧。h型硫氧还蛋白在细胞质基质和线粒体中均有分布，参与多种生物学过程[3]。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、 水 稻 （Oryza sativa）、 大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、葡萄（Vitis vinifera）、柑橘（C.spp.）基因组中均发现多个h型硫氧还蛋白，但只有少数蛋白的生物学功能比较清楚。其中，大豆中一个h型硫氧还蛋白参与大豆根瘤的发育和共生状态的维持[4]。拟南芥AtTRXh5通过非典型机制参与victorin代谢通路[5]。此外，研究发现拟南芥AtTRXh9可以在细胞间移动，有可能参与细胞通讯[6]。水稻OsTRXh1基因受脱落酸和盐胁迫诱导，在水稻种子萌发和植株发育过程中发挥重要作用[7]。在甘蓝型油菜中过表达拟南芥AtTRXh2提高了植株对氧化胁迫和盐胁迫的耐受性[8]。【本研究切入点】前人从多个方面探究了h型硫氧还蛋白的功能，但是其参与植物和病原菌互作的研究较少。前期工作中，笔者通过转录组分析发现了一个受柑橘黄龙病诱导的h型硫氧还蛋白基因，在甜橙(C.sinensis)、道县野橘(C.daoxianensis)、宜昌橙(C.ichangensis)的感病植株中均上调表达。目前，柑橘属中关于硫氧还蛋白功能研究的报道较少，硫氧还蛋白参与柑橘免疫反应的作用尚需进一步研究。【拟解决的关键问题】本研究拟通过克隆甜橙中硫氧还蛋白基因CsTRXh1，进行表达分析和亚细胞定位分析，为深入研究硫氧还蛋白参与柑橘黄龙病应答反应的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为赣南师范大学柑橘种质资源圃提供的甜橙品种纽荷尔（Newhall）。分别取3株前期鉴定为健康和感染黄龙病的纽荷尔脐橙叶片，液氮速冻后保存于-80 ℃备用。

1.2 甜橙叶片总RNA提取与cDNA合成

甜橙叶片总RNA提取使用Easy RNA Kit试剂盒（易思得公司生产）。利用Nanodrop one超微量紫外分光光度计测定所提取总RNA的浓度和纯度，通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA的完整度，参照聚合美公司反转录试剂盒（M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover）合成纽荷尔脐橙cDNA。

1.3 基因克隆

从甜橙基因组数据库（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）中获得CsTRXh1基因的同源序列，根据CsTRXh1基因的同源序列设计扩增引物CsTRXh1-F和CsTRXh1-R（表1）。所用引物全部由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 基因CsTRXh1克隆、定量分析和载体构建所用引物序列Table 1 Primer sequence used for cloning, expression analysis, and vector construction of CsTRXh1

PCR反应体系50 μL，包含纽荷尔脐橙cDNA模板 2 μL，2 × PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25 μL，正向和反向引物各 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR 扩增程序为：94 ℃ 预变性 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃15 s，30个循环；72 ℃ 10 min。使用1.2%琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物，由易思得琼脂糖凝胶回收试剂盒（DR0101050）回收目的片段，将其连接至全式金生物公司的平末端T载体pEASY-Blunt Cloning Vector，转化到大肠杆菌Top10感受态细胞中，经过蓝白斑筛选后，挑取白色单克隆，送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.4 生物信息分析

通过在线软件ProtParam[9]和SOPMA[10]预测蛋白质分子量、等电点、蛋白稳定性和二级结构；利用CLC sequence viewer 8进行蛋白质序列比对；用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）预测蛋白保守结构域。在甜橙基因组（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）、拟南芥基因组（www.arabidopsis.org）和NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中检索并下载同源蛋白序列，用MEGA 11软件[11]进行同源蛋白的系统发育树构建。

1.5 基因表达分析

使用PrimerQuest Tool设计CsTRXh1基因的定量引物CsTRXh1-q-F和CsTRXh1-q-R（表1），qRT-PCR使用聚合美生物的M5 HiPer Realtime PCR Super mix，20 μL反应体系，组分为M5 HiPer Realtime PCR Super mix 10 μL，定量引物正向和反向引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 补齐至 20 μL。以柑橘GAPDH基因为内参基因，引物为GAPDH-F和GAPDH-R（表1）。qRT-PCR反应程序为：95 ℃热启动变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；60 ℃梯度升温至95 ℃，每秒升温0.15 ℃。qRTPCR结果使用2-ΔΔCt法[12]进行分析，所得表达数据在SPSS 26中使用单因素ANOVA进行显著性分析。

1.6 植物表达载体构建和亚细胞定位分析

通过同源重组法将CsTRXh1基因插入植物双元表达载体pCAMBIA2300-GFP上，双酶切位点分别为SacI和XbaI，包含同源接头的扩增引物为CsTRXh1-2300-F和 CsTRXh1-2300-R（表1），扩增体系同方法1.3，检测正确后获得重组植物表达载体pCAMBIA2300-CsTRXh1-GFP，将重组载体转化至农杆菌EHA105感受态中，挑取单克隆菌落检测，将正确菌落摇菌扩繁后瞬时转化本氏烟草叶肉细胞，培养2~3 d后使用共聚焦显微镜进行荧光观察。

2 结果与分析

2.1 甜橙CsTRXh1基因的cDNA全长克隆

使用甜橙叶片cDNA为模板，通过PCR扩增后，获得1条约360 bp大小的基因片段，与预期结果一致。扩增产物胶回收后，连接至T载体上，经过蓝白斑筛选，将阳性克隆测序，基于测序结果获得甜橙CsTRXh1基因的完整开放阅读框，长度为360 bp，编码119个氨基酸残基（图1）。

2.2 CsTRXh1蛋白的理化性质分析

CsTRXh1蛋白分子式为C591H940N150O172S6，相对分子质量为13.09 kDa；带负电荷的氨基酸残基16个，带正电荷的氨基酸残基13个，等电点为5.37；稳定系数为23.09，属于稳定蛋白。CsTRXh1蛋白的二级结构由4种卷曲类型组成，分别为α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲（表2）。其中α-螺旋占比最高，为47.90%；其次为无规则卷曲，占22.69%；然后是延伸链，占19.33%；β-转角包含位点数量最少，为10.08%。CsTRXh1蛋白的C末端主要由α-螺旋组成。

表2 CsTRXh1蛋白的二级结构组成Table 2 Secondary structure of CsTRXh1

2.3 CsTRXh1序列比对和系统发育分析

通过Blastp搜寻甜橙CsTRXh1蛋白在克莱门柚(C.clementina)、 芒 果 (Mangifera indica)、 可 可(Theobroma cacao)、枣 (Ziziphus jujuba)、梅 (Prunus mume)、苹果 (Malus domestica)、油菜 (Brassica napus)和拟南芥等物种中的同源基因，并利用CsTRXh1和同源基因的氨基酸序列进行序列比对与构建系统发育树。

序列比对结果表明，CsTRXh1和其他物种中的同源蛋白高度保守，序列相似度较高（图2）。甜橙CsTRXh1蛋白与克莱门柚TRXh蛋白相似性最高，达到99.2%；与苹果TRXh蛋白相似性最低，为83.9%。

系统发育分析表明，CsTRXh1及其同源蛋白分为三簇（图3），其中，梅、苹果、枣和可可的TRXh1蛋白聚为一簇（I），甜橙、克莱门柚和芒果的TRXh1蛋白聚为一簇（II），油菜和拟南芥的TRXh1蛋白聚为一簇（III）。系统发育分析结果表明甜橙、克莱门柚和芒果的TRXh1蛋白之间亲缘关系较近，与油菜和拟南芥亲缘关系较远。

2.4 CsTRXh1基因表达分析

对感染黄龙病与健康纽荷尔成熟叶片进行CsTRXh1相对表达分析，发现CsTRXh1在感染黄龙病的纽荷尔叶片中上调表达，是健康叶片表达水平的4.23倍（图4）。表明CsTRXh1的表达在黄龙病菌入侵柑橘过程中受到诱导。

2.5 CsTRXh1蛋白的亚细胞定位分析

通过激光共聚焦显微镜观察CsTRXh1在烟草中的亚细胞定位，发现对照绿色荧光蛋白在细胞中均有分布，CsTRXh1在细胞中分布在细胞质和细胞膜（图5），推测CsTRXh1的亚细胞定位与其参与细胞氧化还原反应的生物学功能相关。

3 讨论与结论

在植物抗病反应中，活性氧产生是一个常见的应答过程。活性氧发挥多个生物学功能，包括作为抗菌剂、增强植物细胞壁结构、诱导细胞过敏性坏死、激活邻近细胞的防卫反应和参与系统获得性抗性的建立等[13,14]。甜橙感染黄龙病后，其韧皮部过氧化氢含量显著升高，而活性氧清除剂可以抑制过氧化氢积累[2,15]。在植物细胞内，活性氧清除需要复杂的酶组分体系，包括超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、硫氧还蛋白（TRX）、谷胱甘肽S转移酶（GST）、过氧化氢酶（CAT）等[16,17]。本研究利用同源克隆法从甜橙中克隆1个h型硫氧还蛋白基因CsTRXh1。蛋白序列分析表明，CsTRXh1含有保守的Thioredoxin结构域，系统发育分析结果显示，CsTRXh1与其他h型硫氧还蛋白聚为一簇。这些为CsTRXh1蛋白的功能研究提供基本线索。

由于引起柑橘黄龙病的韧皮部杆菌尚不能进行离体纯化培养，其致病机理仍不清楚[18]。利用芯片技术比较耐病种质粗皮柠檬和感病种质甜橙感染黄龙病后差异代谢途径，发现粗皮柠檬中细胞壁合成相关基因和多个β-1,3-葡聚糖酶基因上调表达[19]。同样地，通过芯片比较感染黄龙病甜橙品种哈姆林和瓦伦西亚及健康甜橙的果皮、维管以及果肉中转录本的变化，发现柑橘黄龙病显著影响转运蛋白和碳水化合物代谢相关基因的表达水平，此外，一个硫氧还蛋白基因（Cit.20400.1.S1_s_at）表达量上调高达7.4倍[20]。使用RNA-seq技术解析耐病种质箭叶橙与感病种质甜橙的差异表达基因，结果表明多数参与细胞壁代谢和次生代谢相关的基因在感染黄龙病的箭叶橙中上调表达，不同的是硫氧还蛋白M3基因在感染黄龙病的甜橙中下调表达[21]。本研究中，利用qRT-PCR技术检测感染黄龙病与健康纽荷尔脐橙中硫氧还蛋白基因CsTRXh1的表达水平，发现CsTRXh1在感染黄龙病的纽荷尔脐橙中上调达4.23倍。因此，推测硫氧还蛋白参与柑橘黄龙病的免疫应答，但是不同成员的功能存在差异。

本研究克隆得到了甜橙中一个硫氧还蛋白基因CsTRXh1，其编码的蛋白质二级结构主要由α-螺旋和延伸连组成，CsTRXh1受黄龙病菌侵染诱导表达，在细胞中定位于细胞质和细胞膜。这些结果表明CsTRXh1参与黄龙病菌入侵生物学过程的应答，后续研究可以进一步通过农杆菌介导法将CsTRXh1基因遗传转化甜橙，获得过表达株系后，检测转基因植株对柑橘黄龙病的抗性，将有助于进一步揭示CsTRXh1基因的功能，为解析硫氧还蛋白参与柑橘黄龙病应答反应的分子机制提供参考。