郑媛媛综述，翁晓滨，王跃嗣审校

0 引 言

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一种以运动和非运动症状为特征的进行性神经退行性疾病，主要病理表现为黑质纹状体中多巴胺能神经元的丧失，其典型临床症状为运动迟缓、肌强直、震颤及一系列自主神经、认知功能障碍等[1]。当前PD的治疗措施包括药物及手术治疗，药物治疗(如左旋多巴制剂)可通过补充多巴胺(Dopamine，DA)进而有效缓解PD患者的运动功能，但药物疗效随疾病进展而消失[2]。目前，深部脑刺激(deep brain stimulation，DBS)是治疗PD的最常见和有效的手术方法，可改善PD的运动障碍，但DBS不能阻止步态/平衡障碍和痴呆的进展[3]。目前，基于干细胞生物学蓬勃发展，细胞替代疗法应运而生。细胞替代疗法是指将细胞直接作为药物，并通过运用细胞移植技术，将有功能的正常细胞替代病变细胞或衰老死亡的细胞，从而达到对多种疾病进行治疗的目的，相关基础研究、临床试验和部分细胞药物已经取得巨大治疗进展。因此，通过移植细胞来替代受损的DA神经元在治疗PD症状方面具有巨大潜力[4]。

细胞重编程作为一种新技术，为治疗PD提供了新的方向，在再生医学领域具有重要的应用和发展前景。能将分化细胞的基因组从一种细胞类型表达谱转化为另一种类型表达谱。研究证明通过在胚胎干细胞培养的条件下引入四种因子OCT3/4、SOX2、C-MYC和KLF4，能够将小鼠胚胎或成体的成纤维细胞诱导为多能干细胞[5]。2007年，Yu等[6]通过转染逆转录病毒介导的OCT3/4、SOX2、KLF4和C-MYC或慢病毒介导的四种因子OCT4、SOX2、NANOG和LIN28在人体皮肤成纤维细胞中的表达，成功生成诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。iPSCs能够避免免疫系统对异体干细胞的排斥，因此在细胞治疗与再生医学等方面具备重要的发展前景[7]。然而，iPSCs衍生的神经干细胞和多巴胺神经元可能含有一些残留的未分化细胞和外源肿瘤相关基因整合，因此iPSC治疗PD可能存在致瘤风险[8]。细胞直接重编程技术，也叫细胞转分化[9]，是近年来研究发现的一项新技术，可使一种成熟细胞在所需组织中原位转化为另一种成熟细胞，不需经过诱导神经干细胞(induced neural stem cells，iNSCs)或iPSCs的过程，能够克服iPSCs治疗PD的局限性。体细胞直接重编程主要通过不同的表观遗传修饰改变原始细胞谱系特异性基因的表达，而不改变基因组序列[4]。本文主要阐述iPSCs和iNSCs治疗PD的局限性，总结体细胞(成纤维细胞和星形胶质细胞)直接重编程为诱导多巴胺神经元(induced dopamine neurons，iDNs)的方法，并探讨体细胞直接重编程为iDNs的优缺点。

1 iPSCs治疗PD的局限性

iPSCs具备无限自我更新能力，能够诱导分化为多种细胞类型[10]，其被广泛应用于疾病造模和移植治疗等方面[11]。研究证明通过在胚胎干细胞培养的条件下引入四种因子OCT3/4、SOX2、C-MYC和KLF4，能够将小鼠胚胎或成体的成纤维细胞重编程为多能干细胞[5]。2007年，Takahashi等[12]又利用上述4种转录因子将人成纤维细胞重编程为iPSCs，因此能为患者提供个性化的治疗干细胞。随着研究的不断深入，科研人员通过非病毒方法也产生了iPSCs，奠定了其应用于医学研究领域的基础[13]。

尽管iPSCs治疗PD已经进入早期临床实验阶段，但目前依旧存在诸多问题，仍需对其进行优化和解决。第一，致瘤性。因为iPSCs的增殖能力，形成肿瘤的几率很高[14]。Yamashita等[15]证明未分化的iPSCs具有较高的致瘤性；第二，异质性。Samata等[16]表明人iPSCs在产生过程中，存在转染的不均一性，不可避免的含有异质性细胞；第三，分化的不确定性。由于iPSCs的分化机制尚待研究，导致产生iPSCs的效率较低，细胞纯度不够，往往需通过再次增殖，但是在增殖过程中其分化过程具有不确定性[17]；第四，基因突变。iPSCs能够进行自体细胞移植，但所需的成本和时间在很大程度上阻碍了基于患者特异性iPSCs方法的使用，且来自PD患者的自体iPSCs，可能含有影响移植治疗预后的致病基因突变[18-19]。

2 iNSCs治疗PD的局限性

iNSCs可进行自我更新和多向分化[20]，由成体细胞经过细胞重编程过程获得。2014年，Monni等[21]将人胎儿NSCs移植到大鼠6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤的大脑中，可以缓解动物模型PD大鼠的运动障碍，并发现移植的细胞在宿主大脑中存活。研究表明将小鼠的成纤维细胞直接转化为iNSCs后，将iNSCs移植到小鼠6-OHDA病变部位，移植的iNSCs分化为iDNs并迁移到6-OHDA损伤小鼠的黑质中，能够改善PD小鼠的运动缺陷[22]。

虽然相关的动物实验已经表明移植iNSCs可以缓解PD的运动行为，但仍存在局限性，包括伦理、体内追踪iNSCs的困难等方面的问题[14]。并且目前尚不清楚iNSCs是否能产生适应病理环境的功能性神经元，诱导过程中是否导致神经元中其它关键神经元基因的异常表达[23]。此外，还需验证经体外重编程获得的细胞能否在体内存活，并发挥其正确的生理功能等[23]。

3 体细胞直接重编程为iDNs

细胞直接重编程技术，可使细胞在所需组织中原位转化，而无需经过中间的多能状态。转分化的细胞表现出与多能细胞及其体细胞分化而来的细胞相同的功能，在体内移植后也不显示致瘤性[24]，且效率更高，为治愈PD方面带来新曙光。现在有多种细胞类型可以诱导分化形成iDNs，最常见的有成纤维细胞和星形胶质细胞。

3.1成纤维细胞直接重编程为iDNs

3.1.1 利用转录因子将成纤维细胞直接重编程为iDNs2011年，Pfisterer等[25]通过在慢病毒载体中过表达三种转录因子ASCL1、BRN2和MYT1L与两个基因FOXA2和LMX1A，首次将人胚胎和出生后成纤维细胞直接重编程为功能性iDNs，但效率较低，TH+的iDNs只占Tuj1+的神经元总数的10%左右。2011年，Caiazzo等[26]表明3种转录因子ASCL1、NURR1和LMX1A能够将小鼠和人类成纤维细胞直接重新编程为功能性iDNs，TH+的iDNs占Tuj1+的神经元总数的80%，其释放DA并表现出规律的电活动。然而，在这些研究中，重编程iDNs的基因表达谱与原有中脑iDNs存在不同[27]。2011年，Kim等[27]通过6个转录因子LMX1A、NURR1、FOXA2、EN1、ASCL1、PITX3以及两种神经营养因子SHH和FGF8组合，将小鼠尾尖的成纤维细胞直接重编程为iDNs，将其移植入PD小鼠模型中可以改善动物的运动缺陷。2014年，Hong等[28]通过两种转录因子ASCL1和NURR1以及两种神经营养因子SHH和FGF8b的组合，将小鼠的胚胎成纤维细胞直接重编程为iDNs，iDNs的重编程效率约为(33±0.62%)。2015年，Zheng等[29]通过利用3个转录因子BRN2、SOX2和FOXA2，将小鼠胚胎成纤维细胞和人类成纤维细胞直接重编程为多巴胺能前体(DPs)，移植结果表明，DPs分化为iDNs，并缓解了PD小鼠模型的运动缺陷，在小鼠大脑中未检测到肿瘤。以上研究结果显示，利用转录因子能够将小鼠和人类的成纤维细胞转分化为功能性iDNs，其移植到动物模型中能长期存活，且能改善动物的运动症状。

3.1.2利用小分子和细胞因子将成纤维细胞直接重编程为iDNs小分子诱导体细胞重编程不会使基因组受到破坏，其可使体细胞转化为其他种类的细胞[30]。科学家发现特定的小分子可代替转录因子，使用方便快捷，且小分子无载体，可避免从病毒载体引入转基因，其安全性较高，研究者可通过精确调整小分子的最佳浓度以提供最佳的效果[31]。2020年，Qin等[32]利用小分子和细胞因子的组合，即丙戊酸(valproic acid，VPA)，Respox，kenpaullon，forskolin，Y-27632，purmorphamine，SHH和鸡尾酒(FGF-8b，bFGF，Wnt1及Wnt5a)，成功将人成纤维细胞直接重编程为iDNs样细胞，而无需转染外源基因，且该细胞表现iDNs样形态和标记物，并具有神经元的电生理特性。其研究结果显示，大约87.9%的成纤维细胞转化为TUJ1+/TH+神经元，表明在小分子和细胞因子诱导后可能产生高产量的DA神经元样细胞。与将体细胞重编程为iPSCs再诱导分化为iDNs的方法相比，利用小分子和细胞因子将人成纤维细胞直接重编程为iDNs的方法简单且效率高。综上所述，通过利用小分子和细胞因子直接重编程产生iDNs的方法，避开转录因子对基因组的整合，为治疗PD带来新进展。

3.1.3利用转录因子和小分子将成纤维细胞直接重编程为iDNs2014年，Pereira等[33]使用转录因子ASCL1、BRN2、MYT1L、LMX1A、LMX1B、FOXA2、OTX2与小分子化合物(CHIR99021、SB431542、Noggin、LDN193189)的组合，有效地将人胎儿成纤维细胞转化为特定的iDNs，表达TH的神经元的平均数量为(503.4±205.5)。转录因子与小分子的结合可减少直接重编程所需转录因子基因的数量，并且可降低将外源基因整合到体细胞染色体中而引起的基因突变和致瘤性的潜在风险[34]。

3.1.4利用miRNA和转录因子将成纤维细胞直接重编程为iDNsmiRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA，其可作为基因表达的转录后调节因子[35]。其在大脑发育方面有着至关重要的作用，如神经形成、神经元成熟、突触形成、轴突导向和神经元可塑性[36]。miRNA不改变基因组且不引发致瘤性，其进行细胞重编程时不存在小分子化合物的毒性和外源基因的参与。既往研究证明，miRNA的特异性缺失，导致中脑iDNs进行性丢失[37]，证明miRNA在中脑iDNs形成、存活和功能中起关键作用。研究证明，使用两种转录因子(MYT1L和BRN2)与miR-124相结合，有可能将人成纤维细胞转化为功能性神经元，尽管这些神经元具有功能性，但它们的亚型并未明确定义[38]。Jiang等[39]将三种转录因子ASCL1、NURR1、LMX1A与miR124和p53-shRNA结合，协同抑制p53并诱导人胚胎肺成纤维细胞生成iDNs，其结果表明抑制p53可以使细胞周期停滞在G1期，可显著提高人成纤维细胞向iDNs的转化，Tuj1+神经元的转化效率从17.9%提高到31.1%，TH+神经元的转化效率达到15.4%。Gregorio等[36]使用miR-34b/c结合两种转录因子ASCL1、NURR1可将成纤维细胞直接重编程为iDNs，其与人类中脑DA神经元的电生理特性一致，效率为19.5%。结果表明miR-34b/c可调节Wnt1信号通路的表达，促进细胞周期退出并诱导DA分化，miR-34b/c使转分化的效率加倍。因此，miRNA与关键转录因子具备联合作用，可增强iDNs体外生成的能力。

3.2星形胶质细胞直接重编程为iDNs

3.2.1 利用miRNA和转录因子将星形胶质细胞直接重编程为iDNs2017年，Romanov等[40]将miR218和三种转录因子ASCL1、NEUROD1、LMX1A联合使用，将体外人类星形胶质细胞和体内小鼠星形胶质细胞直接重编程为iDNs，重编程效率高达16%。其能表达中脑特异性转录因子和典型DA标记物，可缓解PD小鼠的步态障碍。将星形胶质细胞在PD小鼠体内转分化为功能性iDNs，而不需要经过细胞移植，因此生成功能性iDNs的过程得到简化[41]。

3.2.2利用CRISPR-CasRx系统将星形胶质细胞直接重编程为iDNsCRISPR-CasRx基因编辑系统的出现改变了修饰核酸的能力，CRISPR/Cas13系统已被用于靶向RNA[42]。研究表明，在动物模型PD小鼠体内利用CRISPR-CasRx系统敲降PTBP1，可将星形胶质细胞直接重编程为iDNs且效率高，并减轻了PD小鼠模型中的运动缺陷[43]。CasRx是Cas13d家族的成员，其表现出较高的效率以及靶向特异性，并显示出巨大的治疗潜力[44-45]。相比于利用转录因子直接重编程的方法，该技术可提高直接重编程的效率；相比于敲降RNA的方法，该技术可显著降低脱靶效应；CasRx不会引起DNA的改变且安全性更高[43]。

3.2.3利用敲降RNA结合蛋白PTB将星形胶质细胞直接重编程为iDNs2020年，Fu等[46]证明在PD模型小鼠的中脑敲降RNA结合蛋白PTB，可将小鼠和人类的星形胶质细胞直接重编程为iDNs，重建黑质-纹状体回路，并可有效恢复小鼠的运动功能。然而，2021年，Wang等[47]证明了体内的星形胶质细胞不能通过过表达NEUROD1或敲降PTBP1直接重编程为神经元，其直接重编程的神经元实际上是大脑的内源性神经元。因此，对星形胶质细胞通过敲降或过表达转录因子重编程为iDNs有待进一步研究。

4 体细胞直接重编程为iDNs的优缺点

将体细胞直接重编程为iDNs具有以下几个显著优点：第一，相比于iPSCs，体细胞直接重编程为iDNs无需经过中间的多能状态，致瘤性降低；第二，与iPSCs相比，体细胞转分化为iDNs所需要的时间更短，效率更高[48]；第三，与iNSCs相比，体细胞可在PD小鼠体内转分化为iDNs，但没有研究报道在PD小鼠体内转分化形成的iNSCs可诱导分化为iDNs；第四，可在患者体内将自身体细胞转分化为iDNs，避免免疫排斥反应[41]。

虽然将体细胞转分化为iDNs优点居多，但目前仍存在以下问题：第一，将体细胞直接重编程获得的iDNs不能持续保持其性状，若提前结束重编程技术，iDNs会转为其前性状[49]；第二，经体内转分化获得的iDNs的安全问题没有在人体内验证[40]；第三，进行人体内iDNs重编程，需要开发特定于细胞类型的有效重编程方法，以选择性的靶向所需细胞类别，同时避免可能对其它细胞造成损害[50]；第四，细胞已经过有丝分裂，因此可用性有限[51]。

5 结语与展望

近年来，细胞重编程技术为治疗神经退行性疾病带来新的期望。目前，应用于PD治疗的细胞主要有：iPSCs、iNSCs和iDNs。其中iPSCs治疗PD的方法是最经典的，但无法避免移植到大脑或其它器官后形成肿瘤等极端问题；iNSCs则具备自我更新及多向分化的能力，因而可提供充足的细胞来源，但存在体内追踪iNSCs的困难等问题；而iDNs治疗PD无需经过多能干细胞的中间过程，所需时间更短，效率更高，在体内移植后也不显示致瘤性等问题，可在患者体内将自身体细胞转分化为iDNs，不存在免疫排斥反应。利用体细胞直接重编程为iDNs来治疗PD已成为科学发展的必然选择。

体细胞(成纤维细胞和星形胶质细胞)可通过利用转录因子、小分子、miRNA、CRISPR-CasRx系统等直接重编程为iDNs。但目前仍存在一些问题需要探讨：首先，采用病毒转染的方法可能出现基因整合及肿瘤发生；其次，虽然小分子不会引起基因整合，但小分子潜在的安全性问题有待研究，其临床应用是否会受限制目前尚不清楚；最后，将患者的体细胞转分化为iDNs后，将其注射入患者大脑内可能出现安全问题。未来可对以下两方面进行研究：一是寻找安全有效的转染方法，以期将直接重编程获得的iDNs成功应用于临床；二是采用在体内诱导多巴胺神经元原位再生的方法，改善将iDNs注射入患者大脑内可能会存在的安全问题。这一系列问题一旦得到解决，体细胞直接重编程技术在PD治疗中将具有不可估量的应用价值。