程欣荣，吴耀越，黄宇柯，朱仁启，陈文思，陈守斌，初 洋

（烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005）

真菌是隶属于真菌界（Kingdom fungi）的一大类异养真核生物。真菌界下又涵盖了子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门 （Basidiomycota）、接合菌门（Zygomycota）、壶菌门（Chytridiomycota） 及其他无性型真菌[1]。真菌的主要特征为细胞内有细胞核，无叶绿体，细胞壁含有几丁质。真菌在自然界中作为分解者，可分解动物、植物组织，将其中的有机物分解为简单无机物后，供生态系统中生产者利用。野生大型真菌即为生长于自然野外环境下的大型真菌，大型真菌又可称为蕈菌或菌物，是指具有明显的、肉眼可辨子实体的真菌[2]。野生大型真菌主要属于担子菌门，另有部分属于子囊菌门。很多野生大型真菌除其生态作用外，还具有较高的食用和药用价值，长期以来受人青睐。

中国野生真菌资源丰富，分布约有世界已知真菌1/7的种类，其中食用真菌约1 200余种[3]。此外中国也是最早研究食用菌栽培的国家之一，目前我国已经驯化栽培的野生食用真菌主要有双孢蘑菇（Agaricus bisporus）、毛头鬼伞 （Coprinus comatus）、猴头菇（Hericium erinaceus）、糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）、金针菇 （Flammulina velutipes）、金顶侧耳 （Pleurotus citrinopileatus）、杏鲍菇 （Pleurotus eryngii）等80余种[4]。

野生食（药）用真菌从野外采集到人工大规模栽培需要经历鉴定、引种、驯化栽培3个环节。鉴定旨在鉴定所采集的野生大型真菌的种类，以判断该种野生大型真菌是否具有食（药）用价值；若经鉴定为食（药） 用菌，则可以继续进行引种流程。引种主要是将采集到的食（药）用真菌子实体制作成菌种；期间研究其菌丝生物学特性（包括最适碳氮源、碳氮比、温度、pH等），并根据其菌丝生物学特性进一步确定其最适母种、原种配方。驯化栽培主要为探究如何在人工培育环境下，在培养基中实现野生食（药）用真菌的子实体生长，得出最佳培养基配方及开袋方式、培养温度等，以提高产量。

1 野生食（药）用真菌的鉴定

1.1 野生食（药）用真菌的形态学鉴定

形态学鉴定是真菌鉴定最传统、最基本的环节，其主要依据为真菌是否为单细胞以及其菌盖、菌柄、菌环、菌托、菌肉、菌褶或菌管的特征，孢子印颜色及形态、孢子形态、担子形态、担子梗数量、囊状体形态和大小、菌丝形态等。其宏观特征，如菌盖特征、菌柄及菌环特征等，可用目视观察法和直尺测量确定；微观特征，如孢子形态特征、担子形态等，可通过初步制作水封片在光学显微镜下观察及测量，还可进一步制作石蜡包埋切片进行观察[5]。

1.2 野生食（药）用真菌的分子生物学鉴定

传统鉴定具有局限性。野生真菌子实体发育阶段或所处环境等客观因素以及人为主观判断均会影响鉴定结果，特别是对于形态特征极为相似的同属菌株，很难鉴定到种。因此，分子生物学技术的出现提供了准确有效的鉴定方式。

目前分子生物学鉴定技术主要有：DNA中（G+C）含量测定、核酸杂交技术、限制性酶切片段长度多态性分析、电泳核型（EK） 分析、随机扩增多态性DNA分析（RAPD）、rDNA序列分析、多位点酶切电泳（MEE） 等[6]。其中应用最广泛的真菌分子鉴定技术为rDNA序列分析，该技术主要利用18S rDNA 5′端和28S rDNA的3′端之间存在的核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS），其包含2个不同的非编码区域，即ITS1和ITS4，通过对其扩增后与NCBI数据库中的真菌ITS基因序列进行比对，可确定样本的分类地位。rDNA序列分析在真菌分子鉴定上具有很多优点。研究发现，相较于蛋白质编码标记，核糖体标记在PCR引物上存在的问题少，且具有一些通用引物，极大地降低了试验难度；同时ITS是一段中度保守序列，ITS序列表现为种内基本一致，但在种间存在较大差异，其对于大型担子菌和丝状子囊菌具有很高的物种分辨率，保证了鉴定的准确性[7]。耿晓进等[8]利用该技术对秦皇岛地区的肉蘑、噶蘑和松蘑进行了分子鉴定，确定了3种野生食用菌的分类地位分别为色钉菇（Chroogompus rutilus）、浅橙红乳菇（Lactarius akahatsu） 和牛肝菌属的一种真菌（Suillu sp.）；丛倩倩等[9]通过ITS序列和子实体形态学特征鉴别了一株当地称为“白灵芝”的食用菌实为乳白孔栓菌（Leiotrametes lactinea），纠正了市场上以假乱真的现象；杨琴等[10]采用ITS、ef1-α、rpb1以及rpb2片段联合矩阵序列分析，鉴定了采自甘南州的21株野生羊肚菌（Morchella spp.），确定了当地羊肚菌资源类型。除食（药）用真菌鉴定外，该技术还可以广泛应用于植物病害防治、环境检测等其他领域中涉及真菌鉴定的研究，可见其具有极高的可靠性和普适性[11-12]。

2 野生食（药）用真菌的引种

2.1 野生食（药）用真菌的分离方法

目前，野生食（药） 用真菌分离方法主要有3种，即组织分离、孢子分离和基质菌丝分离。野生食（药）用真菌的分离主要采用组织分离，其具体操作是：在无菌条件下，用解剖刀从子实体内部切取小块组织，将其接种于培养基上，经培养后获得菌种。该方法具有易于操作、稳定可靠等优点，故成为真菌分离最常用的方法。研究发现，组织分离所切取的组织块大小对分离后菌丝生长速率会产生影响，该影响因真菌种类的不同而异。有些菌类组织块越大菌丝生长速率越快；而有些菌类却相反，如双孢蘑菇中切取小组织块更有利于其菌丝体生长[13]。孢子分离常用于某些食（药）用真菌子实体内部组织极少而难以分离或进行单孢杂交育种的试验，野生食（药）用真菌的初次分离较为少用。基内菌丝分离即从已有真菌生长的基质上获取基质内菌丝进行分离[14]，多用于某些食（药） 用真菌内部组织极少或组织再生能力弱的情况，操作上较组织分离法更加繁琐，故较少采用。

2.2 菌种培养基

野生食（药）用真菌分离后的原始菌种称为母种，又称一级种。因为真菌的新生菌丝较嫩弱，分解养分的能力差，故要求母种培养基所含养分丰富，易于被菌丝分解吸收。因此目前母种培养基常用营养类试剂如葡萄糖、蛋白胨、各种无机盐等与自然植物原料马铃薯、黄豆等混合配制培养基，具体添加的营养类试剂种类和配比可以参考菌丝生物学特性。母种培养基为固体斜面培养基，最常用的培养基为PDA培养基，其具有配制简易、普适性高等优点，主要配方为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，水1 000 mL[15]。稍微改变其成分可制成具体适合某种真菌的PDA衍生培养基，如PDA综合培养基、木屑浸汁+PDA培养基、PDTA培养基等[16-18]。棉籽壳这类较难分解的培养料煮汁后配成母种培养基，多种食（药）用真菌可较好地在该培养基上生长；且有些种类如金针菇、香菇（Lentinula edodes）、杨树菇（Agrocybe aegerita） 等在棉籽壳培养基上生长情况优于PDA培养基，与传统母种培养基相比，棉籽壳培养基具有配制简单、原料成本低等优点，非常适合广泛推广运用[15，17，19]。

2.3 原种培养基

原种又称二级种，是指将母种接入瓶装或袋装含有棉籽壳、木屑、麦粒、玉米粒或粪草等原料的培养基后所得到的菌种，配方和种类繁多[20-23]。其主要目的是将母种扩繁，为栽培种做准备。经母种培养后，菌丝分解养分的能力已经较强，故原种培养基配料多采用前述物质直接配成培养基，常用培养形式为瓶装培养。

常用的原种培养基中常含有大量木质素、纤维素和半纤维素，真菌可产生相应的酶将其分解为可利用的营养形式。因此食（药）用真菌的栽培可充分利用废弃的木质素、纤维素等，将其转化为对人类有用的资源，有效防止不正确处理造成环境的污染。研究发现，木质素、纤维素等物质浓度是决定真菌产量的重要因素，Atila等[24-25]研究发现木质素浓度可以直接影响猴头菇（Hericium erinaceus） 和榆干玉蕈（Hypsizygus ulmarius） 的产量，且影响存在差异。因此，探究原种的最适配方对提高食（药）用真菌产量具有重要的意义。

2.4 菌丝生物学特性

充分研究菌丝生物学特性有助于提高野生食（药）用真菌的育种效率和菌种品质。菌丝生物学特性主要包括菌丝生长最适碳源、氮源、pH和环境温度等。

碳源是一类含碳化合物，能在微生物生长时为其提供所必须的碳素。根据其化合物性质不同可将其分为有机碳源和无机碳源。有机碳源主要有糖类、脂肪类、有机酸、醇、烃类，这类碳源常可被异养性微生物所利用；无机碳源为CO2、碳酸氢钠等含碳无机物，这类碳源只能被自养性微生物利用。真菌均为异养微生物，因此培养时应选择有机碳源。氮源给微生物生长提供氮素，被吸收后主要用于合成核酸、蛋白质等生物体内含氮物质，氮源也可分为有机氮源和无机氮源，有机氮源如牛肉膏、尿素等；无机氮源如硝酸铵、硫酸铵等，有机氮和无机氮源均可被真菌利用。除碳源和氮源的单因素影响外，碳源、氮源对真菌还存在交互作用，以碳氮比的形式呈现。碳氮比是培养基有机物中碳的总量和氮的总量的比值，通常以C/N表示[26]。适当的碳氮比有利于真菌菌丝分解利用培养基营养。

培养基pH是影响真菌生长的重要环境影响因素，pH过高或过低均会对真菌生长产生不利影响。常见的喜酸性大型真菌有黑木耳（Auricularia heimuer）、柱状田头菇（Agrocybe aegerita）、芳香杯伞（Clitocybe fragrans）、金针菇、斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）、香菇、多脂鳞伞（Pholiotaadiposa）等[27-33]；喜碱性大型真菌有毛头鬼伞、糙皮侧耳等[34-35]。

适宜的环境温度有利于真菌细胞内细胞代谢的有序进行。最适温度同样也随真菌种类的不同而存在差异。如草菇（Volvariella volvacea）、猴头菇、糙皮侧耳和黑木耳可耐30℃高温[29，35-36]，多数食（药）用真菌在35℃无法正常生长。

对菌丝体生物学特性的研究可以掌握真菌菌丝生长发育的习性，对于开展引种的后续工作具有重要意义。国内对多种真菌的菌丝生物学特性已有比较完整的研究，但根据文献搜索，部分常见食（药）用真菌的菌丝生物学特性研究还不够充分，存在无相关文献或者相关文献年份过于久远的问题。

3 野生食（药）用真菌的驯化栽培研究

3.1 野生食（药）用真菌驯化栽培研究

3.1.1 栽培种

在正式开始大规模栽培前，通常还会将原种制成栽培种。栽培种又称三级种，是指将原种接入瓶装或袋装培养基内所得到的菌种，其主要作用是扩大菌种量，为后期快速、大量生产提供充足菌种。在栽培种完成制作后，将其接种于灭菌后的培养料中即可开始规模生产。栽培种使用的培养基配方通常与原种相同。

3.1.2 出菇时间和出菇方式

多方因素会对真菌生长和出菇时间产生影响。大多数真菌适宜的生长温度为20℃左右，故最适出菇时间多为春季、秋季；有部分真菌可耐受高温，夏季也可出菇；少数种类能在冬季低温条件下出菇。出菇阶段一般要求环境相对湿度约为90%。

出菇阶段的操作方法影响着栽培种的产量，目前常用的方法有搔菌、卧式、立式、直接开袋、直接脱袋、菌袋上划口等。其中搔菌对子实体形成的早晚和数量有影响[37]。而卧式、立式等菌袋摆放方式与直接开袋、直接脱袋等操作的结合，对子实体产量、生长周期以及杂菌污染度均有一定影响。

3.2 有待进一步开发驯化的珍稀食（药）用真菌

按照生长营养条件划分，野生食（药）用真菌可以分为腐生菌、共生菌等。目前，还存在有许多食（药）用真菌未实现人工生产，这类食（药） 用真菌多为共生菌。现今市面上常见的普通野生食（药）用真菌和栽培食（药）用真菌多为腐生菌，腐生菌的栽培较为简单，利用成分简单的培养料装袋或装瓶即可在实验室或厂房环境下实现大规模人工栽培。而许多珍稀食（药）用真菌为与植物共生的菌根菌和非植物共生的真菌，以菌根菌最为常见[38]。代表品种有松茸（Tricholoma matsutake）、鸡油菌（Cantharellus cibarius）、干巴菌 （Thelephora ganbajun）、黑孢块菌（Tuber melanosporus） 等。

菌根菌具有极高的食（药）用价值。研究发现，块菌属（Tuber）菌类富含蛋白质、脂肪酸、多糖、酚类、鞘脂类、甾类等多种营养成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、调节免疫等效能[39]。乳菇属（Lactarius）菌类含有倍半萜、甾醇、牻牛儿酚、凝集素和酶等功能成分，具有抗肿瘤、抗菌等作用[40]。

同时，菌根菌在生态系统中还发挥着重要的生态作用。张胜男等[41]验证了蒜头状小皮伞（Marasmius scorodonius） 和皮伞属（Mycetinis） 的2种菌类对沙地云杉的促生作用；李嘉珞等[42]验证了点柄乳牛肝菌（Suillus granulatus）、口蘑属真菌（Tricholoma sp.）和褐环乳牛肝菌（Suillus luteus）与沙地樟子松幼苗形成的外生菌根可以明显提升沙地樟子松的抗旱能力。段嘉靖等[43]发现丛枝菌根菌和外生菌根菌除了具有植物促生作用外，还具有调节凋落物和土壤有机质分解的重要生态功能。

由于其独特的生长营养条件，菌根菌不能使用腐生菌的栽培方式进行生产，但现在部分菌根菌已经栽培成功。真菌先与植物形成菌根苗，再通过菌根苗栽培出菇。以黑孢块菌为例，其生产通常采用建立栽培园的方式，园区需要位于气候地形和土壤适宜黑孢块菌及其共生树种生长的区域，后在园内引种黑孢块菌的共生树种，如夏栎（Quercus robur）等，以模拟自然生长环境，最后完成菌种接种[44-45]。但这一方式大大增加了生产成本和周期，导致黑孢块菌这类菌根菌价格居高不下，进一步造成野生菌根菌的过度开发，破坏了其生长的自然环境和菌种资源。综上，珍稀菌根菌的人工栽培还亟待进一步研究。

4 总结与展望

对于已有的栽培菌种进行栽培料配方的优化研究可以降低其生产成本，提高产量，改变产品营养结构，使更具有营养的普通真菌以更低的价格面向市场。对于珍稀野生食（药）用真菌的驯化栽培研究可以提高其产量，降低市场价格，扩大受众人群。此外，新驯化栽培的食（药）用真菌可以根据其味道、营养成分、药用价值等特点，开发成各种产品推入市场，获得一定的经济效益。野生食（药） 用真菌的鉴定、引种、驯化栽培研究还有利于调查区域真菌种类分布及物种多样性，增加食（药） 用真菌菌种的遗传多样性，避免菌种老化，以降低珍稀食（药）用真菌灭绝的风险；减少无序乱采，保护野生真菌资源及生物多样性。因此，野生食（药）用真菌的鉴定、引种具有极高的经济和生态价值。

根据文献检索情况可知，目前国内已有许多相关研究，并成功驯化栽培了多种食（药） 用真菌。但珍稀菌根菌的人工驯化栽培研究仍未取得突破性进展。同时，新品种食（药）用真菌的推广入市存在一定难度，目前占据市场的多为较常见的传统食用菌，新品种普遍存在知名度低、市场占有率低的问题。食（药）用菌的人工驯化还有待更多的研究以解决目前的诸多问题，具有广阔的研究前景。