陈晓光，吴晓贤，梁晓薇，卓丽君，刘远超，谢意珍，2，张 智，2，3，吴清平，李向敏，胡惠萍**

（1.广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室广东省微生物安全与健康重点实验室，广东 广州 510070；2.广东粤微食用菌技术有限公司，广东 广州 510663；3.广东粤微生物技术有限公司，广东 韶关 512028）

细脚虫草 [Cordyceps tenuipes（Peck） Kepler,B.Shrestha&Spatafora]，属于真菌界（Eumycetes） 子囊菌门 （Ascomycota） 粪壳菌纲 （Sordariomycetes）肉座菌目 （Hypocreales） 虫草科 （Cordycipitaceae）虫草属（Cordyceps）[1]，与细脚棒束孢（Isaria tenuipes Peck）、细脚拟青霉 [Paecilomyces tenuipes（Peck）Samson]等[3]同物异名。在野外采集大型真菌资源时，仅凭形态学观察并不足以判断其所属的分类地位，需通过分子生物学技术手段进一步确定；真菌核糖体DNA（rDNA） 的内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS） 序列保守性强、包含可变区，能有效反映真菌间的亲缘关系，可在真菌分类鉴定中广泛应用[4]。野外采集、分离的细脚虫草，其无性型曾被命名为细脚棒束孢，属于棒束孢属（Isaria）；该属有玫烟色棒束孢 [I.fumosorosea(Holmsk.)Fr.]、蝉花（I.cicadae Miq.）、环链棒束孢[I.cateniannulata(Z.Q.Liang)Samson&Hywel-Jones]等种类；rDNA-ITS及多基因序列分析表明，棒束孢属的大多数种类是一群遗传相对稳定的古老物种[5]；通过ITS序列分析结合形态学观察，能够鉴别出与棒束孢属相似的种类。

细脚虫草含有真菌多糖、多肽、生物碱、甾醇类和萜类[6]，相关报道其有抗肿瘤[9]、免疫调节、抗氧化、抑菌[10]、降血糖[11]、降血脂、保护肾脏[13]等功效。有研究表明蛹虫草（Cordyceps militaris） 子座提取物对乳腺癌肿瘤细胞MCF-7有抑制作用[15]，但同属于虫草类的细脚棒束孢对乳腺癌肿瘤细胞的体外抑制作用尚未见报道。通过研究人工栽培的细脚虫草孢梗束和菌丝体对乳腺癌细胞的抑制作用，以期为细脚虫草的开发和利用提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

野生菌株采集于浙江乌岩岭国家级自然保护区的苔藓层。

通过孢梗束组织分离得到纯化菌株，编号为HMGIM-W150712，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M2017430。

1.2 试剂与材料

1.2.1 培养基

综合PD培养基：去皮土豆200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1，维生素B1微量。

母种分离培养基：综合PD培养基、琼脂20 g·L-1、蚕蛹粉 5 g·L-1。

母种纯化培养基：孟加拉红培养基、蚕蛹粉5g·L-1。

液体原种培养基：综合PD培养基、蚕蛹粉5 g·L-1。

人工驯化培养料：按照大米与营养液的质量与体积比为1∶1.0至1∶1.2的范围内进行配制；营养液的配方为：葡萄糖10 g、黄豆粉8 g、蚕蛹粉1 g、奶粉1 g、KH2PO41 g，维生素B1微量，溶于水1 000 mL。栽培袋使用17 cm×35 cm×0.005 cm的耐高温聚丙烯袋，每袋装大米58 g，加入营养液58.0 mL～69.6 mL，126℃高压灭菌30 min。

1.2.2 试剂

孟加拉红培养基，广东环凯微生物科技有限公司；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、通用引物 ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） 的合成、二甲基亚砜（DMSO），生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR反应体系试剂，宝生物工程 (大连)有限公司；乙酸乙酯，广州化学试剂厂；肿瘤细胞MCF-7（乳腺癌细胞），中国典型培养物保藏中心；青霉素-链霉素混合溶液（双抗）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶消化液、达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM），海克隆实验室有限责任公司；台盼蓝，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；人工栽培的蛹虫草子座，广东粤微食用菌技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离纯化

取新鲜虫草野生孢梗束，通过组织分离法，用母种分离培养基进行分离培养，挑取未污染菌株的尖端菌丝，经母种纯化培养基纯化得到其斜面纯培养物。

1.3.2 菌丝体ITS序列鉴定和系统发育树构建

斜面纯培养物接种于液体原种培养基培养，收集菌丝，40℃低温烘干，使用液氮研磨，利用DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，得到的DNA溶液于-20℃冷藏备用。通过真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4，进行ITS-PCR试验。

PCR反应液共50 μL，分别为：TaKaRa Taq（5 U·μL-1）0.25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture（dATP、dCTP、dGTP和 dTTP的浓度均为2.5 mmol·L-1）4 μL，DNA模板2 μL，引物1（浓度10 μmol·L-1）5 μL，引物2（浓度10 μmol·L-1）5 μL，灭菌蒸馏水 28.75 μL。

PCR反应条件为：94℃反应5 min；94℃反应1 min，55℃反应1 min，72℃反应1 min，30个循环；72℃反应10 min。

PCR产物直接送检进行双向测序，由华大基因完成。测序结果在NCBI数据库进行序列Blast比对，以冬虫夏草[Ophiocordyceps sinensis（Berk.）G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora]的ITS序列为外类群，以细脚棒束孢、玫烟色棒束孢、环链棒束孢、高雄山虫草（Cordyceps takaomontana Yakush.&Kumaz.）、细脚虫草、蝉花（蝉花在NCBI数据库中参考与其拉丁名I.cicadae为同物异名的C.cicadae的序列） 为参考序列[16]，从GenBank中获取到的菌株信息见表1。

表1 GenBank中获取的菌株信息Tab.1 Strain information obtained from GenBank

数据使用MEGA 7.0软件以Neighbor-joining（NJ）法构建系统发育树，Bootstrap参数设定1 000。

1.3.3 菌株栽培试验

在250 mL液体原种培养基中接入菌株的斜面培养菌块（1 cm×1 cm），25℃恒温摇床避光培养，培养3 d～4 d，制得液体原种。液体原种用无菌水稀释200倍后转接至人工驯化培养料，每袋接入10 mL。接种后在（25±1） ℃、空气相对湿度60%～70%的培养室中避光培养3 d～4 d，向栽培袋充入无菌洁净空气，待菌丝生长至培养料底部；之后在恒温22℃、相对湿度80%的洁净培养房进行原基培养，每天光照10 h，12 d～15 d原基长成；在相同温度、湿度、光照条件下进行孢梗束培养，继续培养38 d～40 d，待大多数孢梗束的长度达14 cm～16 cm，即可采收。试验共接种16个菌袋，测定菌柄长度与孢梗束鲜质量，计算生物学效率。生物学效率（E，%）的计算公式为：

式中：mf为细脚虫草孢梗束的鲜质量（g）；md为培养料的干质量（g）。

1.3.4 孢梗束成分分析

驯化成功的细脚虫草的孢梗束于60℃烘干后，进行成分分析，检测其腺苷和虫草素[21]、虫草酸[22]、蛋白质[23]、粗纤维[24]、粗多糖[25]的含量。

1.3.5 抑制肿瘤细胞对比试验

1）乙酸乙酯提取物的制备

孢梗束提取物：细脚虫草孢梗束经60℃烘干，超微粉碎，用乙酸乙酯浸泡10 h，超声提取2次，每次100 min，合并2次的有机相，经抽滤有机相所得的液体旋转蒸发至无液滴状态，4℃保藏，备用。

菌丝体提取物：采用1.3.3的方法制备液体原种，经抽滤收集细脚虫草菌丝体，60℃烘干；后续与孢梗束提取物的制备方法相同。

子座提取物：取蛹虫草子座，制备方法与孢梗束提取物相同。

2）样品溶液的制备

孢梗束提取物的肿瘤细胞抑制活性试验：配制孢梗束提取物样品溶液，用DMSO溶解孢梗束提取物，配制成质量浓度为50 mg·mL-1的母液，过滤除菌后，用细胞培养液稀释母液，得到质量浓度分别为 25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、75 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1的样品溶液。

肿瘤细胞抑制活性的对比试验：采取与孢梗束提取物母液及样液的处理方法，配制孢梗束提取物、菌丝体提取物、子座提取物的样品溶液质量浓度均分别为 100 μg·mL-1和 200 μg·mL-1。

3） 肿瘤细胞培养

由DMEM、体积分数为10%的FBS、体积分数为1%的青霉素-链霉素混合溶液（双抗）配成细胞培养液，培养肿瘤细胞MCF-7；再将肿瘤细胞MCF-7悬液用细胞培养液稀释至细胞浓度为1×105个/mL，接种于24孔组织培养板上；于37℃、CO2体积分数为5%的组织培养箱中培养4 h，待用。

4） 抑制肿瘤试验

小心吸去24孔培养板里的细胞培养液，分别加入不同质量浓度的样品溶液0.5 mL，每个样品设置3个重复加药孔。对照孔为分别加入0.5 mL相对应浓度的DMSO-培养液（按照1.3.5中样品质量浓度梯度从 25 μg·mL-1～200 μg·mL-1的顺序，对照孔中DMSO的体积分数分别为0.002 5%、0.005 0%、0.007 5%、0.010 0%、0.015 0%、0.020 0%）。将24孔培养板置于37℃、CO2体积分数为5%的组织培养箱中，培养48 h。用胰蛋白酶消化液消化，收集细胞，将细胞悬液与0.4%的台盼蓝按照体积比1∶1混合，进行拒染法染色。死细胞被染成蓝色，活细胞因有完整的细胞膜而不着色，用细胞计数器测定活细胞数，重复3次试验，计算抑制率。抑制率（I，%） 的计算公式为：

式中：Ni为加药孔活细胞数（个/mL）；Nc为对照孔活细胞数（个/mL）。

2 结果与分析

2.1 菌丝体鉴定结果

观察采集到的野生菌株的形态，见图1。

如图1所示，其由多根孢梗束组成；虫体被灰白色或白色菌丝包被；孢梗束长度为2.0 cm～3.8 cm，群生，有分枝；孢梗束柄纤细，黄白色或米黄色，光滑；上部有多个分枝，白色，粉末状；经过初步标本鉴定与无性型蛾蛹虫草（Cordceps polyarthra Möller） 即细脚棒束孢的形态描述一致[26]。

图1 野生的细脚虫草Fig.1 Wild Cordyceps tenuipes

经ITS序列比对，发现该菌株与GenBank中的细脚棒束孢、细脚虫草相似性达100%，其构建系统发育树见图2。

图2 基于ITS序列采用Neighbor-joining法构建系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree was constructed by Neighbor-joining algorithm based on ITS sequence

如图2所示，系统发育树分析表明其与多株细脚棒束孢、细脚虫草、高雄山虫草形成一个分支，结合标本特征与ITS序列分析，参考关于乌岩岭自然保护区细脚棒束孢的研究报道[27]，综合判断供试株菌HMGIM-W150712为该虫草的无性型细脚棒束孢。根据最新国际植物命名法规中的“One fungus=One name”原则以及优先发表原则，将有性型与无性型命名系统统一[28]，该虫草为细脚虫草。其ITS序列已上传至国家微生物科学数据中心，核酸序列提交编号SUB1635219149336。

2.2 菌株栽培试验

经人工驯化后，收获的一潮孢梗束见图3。

图3 人工驯化的细脚虫草Fig.3 Artificial culture synnema of Cordyceps tenuipes

如图3所示，细脚虫草的孢梗束为群生或近丛生，无分枝，纤细光滑，呈现浅黄色至黄色。

该细脚虫草的孢梗束生长期约为66 d，目前试验均可长出一潮。人工驯化的孢梗束长度为10 cm～16 cm，较野生的孢梗束长度（2.0 cm～3.8 cm） 大幅提高；综合统计计算其平均长度为（12.49±1.51）cm。经检测，孢梗束直径为0.1 cm～0.2 cm，平均鲜质量为（15.24±4.18） g/袋，生物学效率达（23.45±6.43） %。

2.3 孢梗束成分分析

对驯化成功的细脚虫草孢梗束进行成分分析，结果见表2。

表2 细脚虫草孢梗束的成分分析Tab.2 Component analysis of synnemata of Cordyceps tenuipes

由表2可知，该细脚虫草脚孢梗束的蛋白质含量高达 51.4 g·100-1g-1，虫草素含量较高为 52.9 mg·kg-1，且含有一定量的腺苷、粗纤维和虫草酸，整体营养价值高。

2.4 抑制肿瘤细胞试验

2.4.1 抑制肿瘤细胞的IC50

细脚虫草孢梗束提取物在不同质量浓度下对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用见图4。

图4 不同浓度的细脚虫草孢梗束提取物对乳腺癌细胞MCF-7抑制作用Fig.4 Inhibition effects of synnemata extracts of Cordyceps tenuipes with different concentrations on breast cancer cells MCF-7

由图4可知，细脚虫草孢梗束提取物对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用随着质量浓度的增加而增强。使用SPSS 21软件对试验数据进行分析计算，得到细脚虫草孢梗束提取物的IC50为66.42 μg·mL-1。

2.4.2 抑制肿瘤效果比较

采用SPSS 21软件的配对t检验，对比细脚虫草的孢梗束、菌丝体以及蛹虫草子座提取物的抑制肿瘤效果，结果见表3。

表3 不同乙酸乙酯提取物对乳腺癌细胞MCF-7抑制作用的对比Tab.3 Comparison of inhibition effects of different ethyl acetate extracts on breast cancer cells MCF-7

由表3可知，在质量浓度为100 μg·mL-1时，样品三者之间有显著差异，细脚虫草菌丝体提取物的抑制率最高。在质量浓度为200 μg·mL-1时，细脚虫草孢梗束提取物与菌丝体提取物的抑制效果差异不显著，但两者分别与蛹虫草子座提取物的抑制效果比较都显示出显著差异。结果表明细脚虫草孢梗束和菌丝体的乙酸乙酯提取物抑制乳腺癌细胞的效果无差别，细脚虫草的乙酸乙酯提取物体外抑制乳腺癌细胞的效果强于蛹虫草子座。

3 讨论

早在1930年，日本学者在米饭培养基上接种细脚棒束孢，成功培养出了高雄山虫草子实体，并首次提出细脚棒束孢是高雄山虫草的无性型，棒束孢属的大多数物种现已被证实为高雄山虫草的无性型[29]。由于目前学术界中虫草属、棒束孢属等分类尚存在较多争议，分类学者对于虫草的分类标准还未能达成完全一致[30]。根据最新国际植物命名法规中的“One fungus=One name”原则以及优先发表原则，将有性型与无性型命名系统统一[28]。Kepler等[2]将棒束孢属的大部分成员移入了虫草属中，将“细脚棒束孢”更名为“细脚虫草”，高雄山虫草确证为细脚虫草的有性阶段，高雄山虫草应归并为细脚虫草；细脚棒束孢是高雄山虫草的无性型，也应归并为细脚虫草；因此，将此虫草菌株归类为细脚虫草是合适的。

虫草是一类十分重要的药用真菌，可以实现人工培养的虫草属真菌主要有冬虫夏草（Ophicordyceps sinensis）[31]、蝉花、蛹虫草、巴西虫草（C.brasiliensis）等[32]，但关于细脚虫草人工栽培的报道较少。此株细脚虫草孢梗束的子实体生长周期约66 d，与Nam等[33]的报道接近，其孢梗束的成功培养可为相关虫草的人工栽培提供一些技术参考。由该株细脚棒束孢的活性成分分析可知，其蛋白质含量高达51.4 g·100-1g-1，显著高于香菇（19.61 g·100-1g-1）、茶树菇（27.63 g·100-1g-1）、草菇（28.0 g·100-1g-1）、蛹虫草（21.6 g·100-1g-1）等食（药）用菌的蛋白质含量[34]，该菌株具有开发高蛋白产品的潜力。

蛹虫草中的虫草素具有抑制乳腺癌肿瘤细胞MCF-7增殖的作用[35]；试验结果显示，细脚虫草孢梗束含有虫草素，其乙酸乙酯提取物能显著抑制乳腺癌肿瘤细胞MCF-7的增殖，且比蛹虫草乙酸乙酯提取物的抑制作用强，由此可推测虫草素在细脚虫草对乳腺癌肿瘤细胞MCF-7的抑制中可能起到一定的作用。已有研究报道，云芝（Trametes versicolor）子实体的乙酸乙酯提取物能够抑制乳腺癌肿瘤细胞MCF-7 增殖，其 IC50为 136.59 μg·mL-1[36]，远高于试验中细脚棒束孢子实体的乙酸乙酯提取物（IC50=66.42 μg·mL-1）。同时此次供试菌株提取物的IC50也低于灵芝的乙醇提取物 （IC50=73.28 μg·mL-1）[37]。这表明此株细脚棒束孢抑制乳腺癌肿瘤细胞MCF-7的作用可能比灵芝、云芝更强，使用较小的剂量可以达到更好的效果。

细脚棒束孢野生种质资源的采集和鉴定是资源利用的初始阶段。后续应扩大研究细脚棒束孢新菌株的各类提取物，挖掘其生物防治[38]、抑菌活性、降血糖、降血脂等生物活性；进一步开展抗肿瘤试验，增加其他肿瘤细胞类型[39]，深入研究其与肿瘤细胞的相互作用机制等方面深入探索，为细脚棒束孢的开发和利用提供科学理论参考。