程荷芳

上海太太乐食品有限公司（上海 201800）

食醋为我国传统的酸性调味品和保存剂，与人们的日常生活息息相关。传统的酿造技术多采用固态或半固态发酵工艺，在开放或半开放式的环境下，通过微生物群落的盛衰交替和协同作用酿制食品的过程[1-3]。国内食醋主要以谷物醋为主，采用谷物为原料，以加入大曲的方式引入多种微生物和酶，通过复杂的糖化、酒精发酵和醋酸发酵等过程而制得[4-5]。霉菌、酵母和醋酸菌属是食醋生产过程中的主要微生物。

食醋除作为酸性调味品和保存剂，还有其他生理作用。已开展研究的食醋功能主要有杀菌抗菌、促进食欲、缓解疲劳、降低血糖、降血压、减肥、美容美颜、抗癌防癌等[6]。Beh等[7]研究表明，醋酸菌产生以醋酸为主的有机酸，对高脂饮食诱导的肥胖小鼠具有良好的抗肥胖和抗炎活性。

食醋酿造是一个复杂的生化和微生物作用的过程，在微生物学研究领域，99%以上的微生物都未（难）被纯培养的，这对于具有高度物种多样性的传统酿造食品食醋而言，进一步了解其微生物群落结构和功能具有更大挑战[8]。随着分子生物学技术的快速发展，传统酿造食品微生物群落结构的研究不仅仅局限于传统的可分离培养微生物研究[9]。高通量测序技术的更新、测序成本的降低及测序通量的扩展等优势不断加强，为直接分析群落中全部微生物的种群组成、分布及其动态演替提供了有利的技术支撑[10-12]。宏基因组测序技术不仅提供更为丰富的微生物物种的基因信息，而且还能有效提高检测效率和结果准确性，为研究者更全面地解析微生物群落结构、变化规律并挖掘潜在的功能基因提供契机，从而得以进一步开展对传统酿造食品的深入探索[13]。

通过综述利用高通量测序及宏基因组测序技术等前沿技术对传统食醋酿造中的微生物进行检测研究，并分析讨论其面临的主要问题和发展趋势，为传统酿造食醋的科学研究和工业化生产提供相关理论基础。

1 大曲中主要微生物研究

大曲是以大麦、小麦或豌豆混合物为原料，经粗粉碎，加入一定量的水后压制成砖状曲坯，人工控制在一定的温度、湿度条件下经过一段时间培养而成的粗酶制剂[14]，食醋大曲的生产环境相对开放，其环境、原料及器具中的微生物均可能溶入大曲体系中，使其集聚了食醋酿造所老古板大部分微生物。为传统的固态发酵如食醋、白酒酿造等过程提供了重要的菌系、酶系和物系。大曲中微生物群落多样，由多种细菌、酵母菌和霉菌等组成。霉菌中最重要的是曲霉菌和根霉菌[15]。

Zheng等[16]利用传统可培养手段从汾型大曲中分离鉴定190株菌株，其包含109种细菌及81种酵母和霉菌。Wang等[17]通过PCR-DGGE方法在中国白酒酿造使用的大曲中检测到米黑根毛霉、布氏犁头霉、米曲霉、土曲霉等霉菌。PCR-DGGE即polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis的缩写，是一种聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术，它无需纯培养，能鉴定出丰度较高或参考数据库中可供参考的基因信息，从而可更全面地了解不同发酵阶段的微生物群落组成[18]。兰玉倩等[19]通过PCR-DGGE指纹技术，分析清香型大曲在制作过程中真菌类的群落演替规律，共检测到毕赤酵母属（Pichia kudriavzevii）、东方伊萨钦基氏菌（Issatchenkla orientalis）、球囊菌门（Glomeromycota）、酵母属（Saccharomyces cerevisiae）、酵母菌属（Saccharomycopsis fibuligera）、地霉（Geotrichum）和根霉属（Rhizopus oryzae）7个真菌分类属微生物。Li等[20]采用高通量测序技术对大曲中细菌和真菌微生物种类及丰度进行分析，每克大曲样品OTU（operational taxonomic unit）（97%）在600以上，对微生物多样性的分析非常有效。李申奥[21]以兼香型白云边酒高温大曲不同发酵阶段9个样品为研究对象，利用高通量测序技术对发酵过程中大曲的微生物群落进行分析，细菌群落16S rDNA扩增子测序分析结果表明，样品OTUs数量在进入培菌期后先剧烈下降，后快速上升，又再次下降与回升，进入储藏期后持续下降；所有样品中共获得117个OTUs分类，优势菌属是糖多孢菌（Saccharopolyspora）、嗜热放线菌（Thermoactinomyces）、未分类的嗜热放线菌（Unclassified Thermoactinomycetaceae）和乳酸杆菌（Lactobacillus）；真菌群落ITS扩增子测序分析结果表明，样品OTUs数量在整个发酵过程中呈现先下降后回升再下降再回升的变化走势；所有样品共获得82个OTUs分类，优势菌属是嗜热菌（Thermomyces），曲霉菌（Aspergillus）和念珠菌（Candida）；相邻时间样品的细菌和真菌群落组成相似。

Nie等[22]通过高通量PCR-DGGE测序技术，研究山西老陈醋大曲中的细菌菌群结构和真菌菌群结构，研究发现山西老陈醋大曲中的主要细菌菌群结构主要包括糖多孢菌（Saccharopolyspora）、葡萄球菌（Staphylacocca）、芽孢杆菌（Bacillus）、链霉菌属（Straphonyces）、魏斯氏菌属（Weisseria）、乳酸菌属（Lactobacilus）、泛菌属（Pantoea）、醋酸菌属（Acetobacter）、单胞菌属（Monomonas）、高温放线菌属（Thermoactinomycetes）、糖单胞菌属（Saccharomonas）、假单胞菌（Pseudomonas）、短小杆菌属（Brevibacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等。真菌菌群结果有复膜孢酵母属（Polycystis）、曲霉菌属（Aspergillus）、毕赤酵母属（Pichia）、红曲霉（Monascus）等。

大曲中的微生物群落通过PCR-DGGE指纹、高通量测序及16S rDNA测序等技术，更好更全面地分析大曲中的微生物群落组成和分布情况，但各微生物在大曲中的主要作用、如何作用，对食醋的风味贡献是正向还是负向的，仍有待进一步探索和研究。

2 醋酸发酵过程中的微生物研究

中国的四大名醋，即山西老陈醋、镇江香醋、四川麸醋及福建永春老醋风味各有特色，除其工艺差异，另一个核心就是与醋酸发酵过程中的微生物有很大关系。下面重点综述醋酸发酵过程中的微生物研究现状。

刘廷锐[23]利用二代基因测序技术探究四川麸醋醋酸发酵过程中细菌菌落的多样性。分析表明在整个醋酸发酵过程中，通过Shannon和ace指数的变化表明发酵初期细菌种类最为丰富，随着发酵的进行，丰富度和多样性开始降低，在末期又处较高位置。乳杆菌属和醋杆菌属在发酵过程中呈优势菌属。此外还有一些丰度较低但伴随整个发酵过程的如葡萄糖杆菌属，假单胞菌属和芽孢杆菌属等。

陶京兰等[24]利用实时荧光定量聚合酶链式反应RT-FQPCR技术监测镇江香醋醋酸发酵过程中微生物的变化情况，并证实醋醅中的微生物主要为醋酸菌、乳酸菌和酵母菌属，三者在细菌和真菌总和占比中超过80%。RT-FQPCR技术是一种通过监测PCR过程中所加入荧光基团的荧光信号，利用已知浓度的标准品绘制标准曲线，并对未知样品进行定量分析的一种核酸定量技术[25]。通过RT-FQPCR技术监测镇江香醋醋酸发酵过程，对醋酸发酵阶段醋醅中的总细菌数、总真菌数、醋酸菌、乳酸菌和酵母菌的动态变化进行定量分析，这对于食醋发酵过程中的控制及提高产品的风味具有重要的生产意义。

牟俊[26]利用高通量测序方法重点分析山西老陈醋发酵阶段乳酸菌和醋酸菌的组成和演替规律，结果显示醋酸发酵过程中，乳酸菌的丰度逐渐降低，而醋酸菌的丰度逐渐增加，共检测到5种乳杆菌，占乳酸菌丰度的98%，瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）占乳杆菌丰度的55%，是最主要的乳酸菌。共检测到12种醋杆菌，占醋酸菌丰度的95%，其中巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）占醋杆菌丰度的70%，是最主要的醋酸菌。通过转录组学对其相互作用机制进行初步解析，为深入了解山西老陈醋发酵过程中的酿造机理提供理论。

王俊奇等[27]利用Illumina Miseq高通量测序技术，分别以16S rRNA和18S rRNA基因为分子标记，对醋酸发酵过程中、1个月成品、1年陈酿和10年陈酿4个主要品质的永春老醋中细菌与真菌群落多样性动态变化进行分析，结果表明，醋酸发酵过程中1个月成品、1年陈酿中的优势细菌皆为α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）和芽孢杆菌纲（Bacilli），属水平以醋酸杆菌属（Acetobacter＞60%）和乳杆菌属（Lactobacillus＞20%）为优势菌，10年陈酿产品中未检测到16S rRNA基因；真菌类群方面，四者皆以酵母纲（Saccharomycetes）和散囊菌纲（Eurotio-mycetes）为优势真菌纲。

聂志强等[28]应用宏基因组测序技术对天津独流老醋醋酸发酵过程中的群落变化研究中发现，在醋酸发酵过程中，醋醅中相对丰度较低的细菌（相对丰度0.01%以上）也发生着较大的变化。其中，类诺卡氏菌属（Nocardioides）的相对丰度呈上升趋势，在末期相对丰度达到0.06%，说明其具有较强的醋酸耐受性。假单胞菌属（Pseudomonas）随着醋酸发酵的进行，其相对丰度从0.14%下降到0.04%后逐渐消失，醋酸对假单胞菌属的影响较大。另外，埃希菌属在发酵前期到中期呈增加趋势，克雷伯菌属仅出现在发酵末期。整个发酵周期中，相对丰度＞0.01%的细菌达10种，食醋固态酿造过程中来源于样品和环境中的多种微生物能自发地繁殖、富集，也是传统食醋风味丰富的主要原因。

Wu等[29]采用宏基因组测序技术对香醋的微生物群落结构和功能微生物进行研究，进而了解与食醋风味相关的微生物菌群。结果显示，食醋中细菌、真核生物和古细菌的相对丰度分别为91.75%，0.19%和8.06%。此外，共有来自951属细菌的蛋白编码基因被鉴定出来，其中42.3%与代谢通路相关、28.3%与遗传信息相关、10.1%与环境信息相关。食醋的风味研究结果表明，乙偶姻是在醋酸发酵过程中提高香醋风味的重要物质，其合成受多种代谢途径的调控[30]。

Lu等[31]通过宏基因组测序技术，在物种水平上揭示乙偶姻代谢途径中微生物分布的差异性。乙偶姻代谢途径主要是在乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脱羧酶共同调控下完成。乙酰乳酸合酶主要由布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri，21.0%）和巴氏杆菌（A.pasteurianus，29.3%）产生；而布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri，26.5%）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri，11.6%）、巴氏杆菌（A.pasteurianus，5.6%）、发酵乳杆菌（L.fermentum，3.2%）和短乳杆菌（L.brevis，2.8%）参与乙酰乳酸脱羧酶的合成代谢。双乙酰是合成乙偶姻主要的前体物质，巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）和4种乳酸菌，包括布氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌和短乳杆菌是醋酸发酵过程中促使双乙酰向乙偶姻转化的功能微生物菌种。

Nei等[32]应用宏基因组测序技术在传统食醋中首次发现相对丰度低于0.1%的念珠藻属（Nostoc），类诺卡菌属（Nocardioides），丙酸菌属（Propionibacterium），克雷伯氏菌属（Klebsiella）和片球菌属（Pediococcus）。此前通过人工培养方式，仅能分离鉴定出食醋在发酵过程中的醋酸菌（主要包括醋杆菌属、葡萄糖杆菌属和葡萄糖醋酸杆菌属）、乳酸菌（主要包括乳杆菌属和乳球菌属）和芽孢杆菌属[33]，宏基因组测序技术大幅提高微生物菌种的覆盖率。

3 结语与展望

通过PCR-DGGE指纹、高通量测序及16S rDNA等测序，不同的大曲检测出的微生物群落分布有差异，大曲中的微生物群落发现大曲中有100余种细菌及80余种真菌；其中细菌菌群结构主要包括糖多孢菌、葡萄球菌（Staphylacocca）、芽孢杆菌、链霉菌属（Straphonyces）、魏斯菌属、乳酸菌属（Lactobacilus）、泛菌属（Pantoea）、醋酸菌属（Acetobacter）、单胞菌属（Monomonas）、高温放线菌属（Thermoactinomycetes）、糖单胞菌属（Saccharomonas）、假单胞菌、短小杆菌属、短杆菌属、不动杆菌属、鞘氨醇单胞菌等；真菌菌群主要有复膜孢酵母属、曲霉菌属、毕赤酵母属、红曲霉、黑根毛霉、布氏犁头霉、米曲霉、土曲霉等霉菌。

利用二代基因测序、RT-FQPCR技术、高通量测序等技术，研究发现醋酸发酵过程的微生物菌属主要优势菌属为乳酸菌属、醋酸菌属及酵母菌属和芽孢杆菌属，醋酸菌属主要包括醋杆菌属、葡萄糖杆菌属和葡萄糖醋酸杆菌属，乳酸菌属主要包括乳杆菌属和乳球菌属。通过宏基因组测序技术，研究发现醋酸发酵过程的乙偶姻代谢途径主要是在乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脱羧酶共同调控下完成。而这2种酶是由以下几种微生物生成布氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌和短乳杆菌[34]。

传统食品食醋种类繁多，风味各异，大部分仍沿用传统的微生物生产工艺，其质量的稳定性与微生物的多样性密切相关。利用先进的分子生物学技术对微生物菌群的研究可为食醋的发酵机理和代谢过程做出重要解析。随着高通量测序技术、PCR-DGGE等生物技术与生物数据库、智能信息化技术的深度结合，最终将实现对传统发酵食品食醋发酵机制的全方位解析，从而推动传统发酵过程的现代化与智能化升级。