崔 悦，王文正，范琢玉，汤鑫淼，冯 波，关 皎，朱鹤云

(吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

黄芪桂枝五物汤出自汉代张仲景所著的《金匮要略》，方中含黄芪、桂枝、芍药、生姜和大枣五味药材，具有益气温经，补气通阳，和血通痹等功效。现代临床主要是用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、糖尿病、颈椎病、脑血栓以及心绞痛等[1-5]。黄芪桂枝五物汤君臣佐使配伍明确，其中黄芪为君，桂枝为臣，芍药为佐，生姜、大枣为使。各药味分工明确，相辅相成，极大地发挥了各自药效。在黄芪桂枝五物汤中，桂枝为臣药，起到了解表和营、通阳散寒的作用。桂枝为樟科植物肉桂Cirmarnomum cassia Presl的干燥嫩枝，其主要化学成分包括：有机酸类化合物、萜类化合物、黄酮类化合物、糖苷类和苷元化合物等[6]。文献报道，桂枝具有多种药理活性，能够缓和肠胃刺激、强心、抗炎、抗血小板凝集和改善微循环等。在临床实践中桂枝可以用于组成多种中药经典方剂，广泛应用于临床各科疾病的治疗[7-10]。桂皮酸是桂枝中的主要活性成分，研究表明，桂皮酸具有解热、镇痛、抑菌、抗氧化、抗病毒、保护血管、利尿等作用。目前，桂枝中桂皮酸的含量测定方法主要为HPLC法[11-13]。近年来，超快速液相色谱法(ultra-fast liquid chromatography，UFLC)由于具有分离速度快、分析时间短等优点，已广泛地应用到了中药成分的含量测定中[14-15]。本研究建立了一种快速准确的方法用于对黄芪桂枝五物汤和桂枝水提物中桂皮酸的含量测定，为黄芪桂枝五物汤的质量控制和配伍规律研究提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 仪器与材料

超快速液相色谱仪(Prominence UFLC型，日本岛津公司)；超声仪(KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司)；电子天平(CPA 225D型，德国赛多利斯仪器有限公司)；粉碎机(FW80型，天津市泰斯特仪器有限公司)；旋转蒸发仪(N-1300型，日本东京理化器械株式会社)；涡旋混匀器(Vortex 3型，德国IKA公司)。

甲醇、乙腈(美国Thermo Fisher)，甲酸(天津大茂化学试剂厂)，纯净水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。除甲醇、乙腈、甲酸为色谱级外，其他均为分析纯。桂皮酸对照品(>98%，成都普菲德生物技术有限公司官，批号：18092601)。黄芪、桂枝、芍药、生姜、大枣(吉林大药房)，以上药材经吉林医药学院李景华副教授鉴定均为药材真品。

1.2 色谱条件

Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm，2.2 mm，日本岛津)；色谱柱温度：35 ℃；检测波长：290 nm；流速：0.4 mL/min；进样体积：5 μL；流动相：0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱程序如下：0～5 min，10%～25%B；5～10 min，25%～35%B；10～15 min，35%～40%B。桂皮酸对照品、桂枝水提物样品、黄芪桂枝五物汤样品及缺少桂枝的阴性样品色谱图见图1。

1.3 黄芪桂枝五物汤的制备

取黄芪药材9 g、桂枝药材9 g、白芍药材9 g、生姜药材18 g、大枣药材4枚于1 L圆底烧瓶，向其中加入10倍量体积的水加热回流2次，每次1 h。过滤后合并两次滤液，并使用旋转蒸发仪浓缩到50 mL，4 ℃保存待用。

1.4 桂枝水提物的制备

取桂枝药材9 g于1 L圆底烧瓶，其余操作同“1.3”。

1.5 阴性样品溶液的制备

取黄芪药材9 g、白芍药材9 g、生姜药材18 g、大枣药材4枚于1 L圆底烧瓶，其余操作同“1.3”。

1.6 溶液的制备

1.6.1对照品溶液的制备

取桂皮酸对照品适量于5 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂进行溶解并定容至刻度，得1.0 g/L桂皮酸对照品溶液，4 ℃保存待用。

1.6.2待测溶液的制备

分别取“1.3”“1.4”“1.5”项下各提取物0.5 mL，于不同50 mL锥形瓶中，向其中加入甲醇溶液25 mL，采用超声法提取30 min，续滤液经0.22 μm微孔滤膜滤过，得各待测溶液。

1.7 分析方法的验证

1.7.1线性关系

取“1.6.1”项下桂皮酸对照品溶液适量于5 mL量瓶中，以甲醇为溶剂制得桂皮酸对照品溶液，浓度依次为0.5、1、2、4、10、20 mg/L，进样分析。线性回归计算时，横坐标X为对照品浓度(mg/L)，纵坐标Y为峰面积，得回归方程。

1.7.2精密度试验

取“1.6.1”项下桂皮酸对照品溶液(4 mg/L)，按“1.2”项下色谱条件连续进样(n=6)。计算桂皮酸峰面积的RSD。

1.7.3稳定性试验

取同一批次黄芪桂枝五物汤和桂枝水提物，按“1.6.2”项下方法处理，于室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算其峰面积的RSD。

1.7.4重复性试验

取同一批次的黄芪桂枝五物汤和桂枝水提物各6份，按“1.6.2”项下制得待测溶液，进样分析并计算桂皮酸的含量和RSD。

1.7.5回收率试验

精密量取已知含量的黄芪桂枝五物汤样品(桂皮酸含量为0.132 mg/mL)和桂枝水提物样品(桂皮酸的含量为0.193 g/L)各9份，每份0.25 mL，分别向各样品中加入相当于样品中桂皮酸苷含量80%、100%、120%的对照品溶液各3份，按“1.6.2”项下方法制得待测溶液，进样分析，并计算桂皮酸的回收率和RSD。

1.8 含量测定

按“1.6.2”项下方法分别制备6批黄芪桂枝五物汤和黄芪水提物待测溶液，进样分析并计算桂皮酸含量。

2 结 果

2.1 分析方法验证

2.1.1线性关系

经线性回归计算桂皮酸的回归方程为

Y=8.1×104X-1.6×104(r=0.999 7)

即桂皮酸在0.5～20 mg/L线性关系良好。

2.1.2精密度试验

经计算桂皮酸峰面积的RSD为0.42%，即仪器具有良好的精密度。

2.1.3稳定性试验

经计算黄芪桂枝五物汤和黄芪水提物中桂皮酸峰面积的RSD分别为0.19%和1.1%，说明上述样品在24 h内稳定。

2.1.4重复性试验

经计算黄芪桂枝五物汤和桂枝水提物中桂皮酸含量的平均值分别为0.132 mg/L(RSD=2.1%)、0.183 mg/L(RSD=1.4%)，即方法具有良好的重复性。

2.1.5桂皮酸的回收率

黄芪桂枝五物汤样品中桂皮酸的平均RSD为0.9%,平均回收率为98.1%;桂枝提取液样品中桂皮酸的平均RSD为0.97%,平均回收率为的98.6%。

2.2 含量测定

6批黄芪桂枝五物汤和桂枝水提物中桂皮酸含量结果见表1。

表 1 黄芪桂枝五物汤和桂枝提取液中桂皮酸的含量(%)

3 讨 论

3.1 流动相的优化

流动相的种类对于待测物的分离和分析具有重要意义。适宜的流动相种类和比例有助于待测物的分析与测定。本研究参考已有文献，分别考察了甲醇-水、甲醇-0.2%醋酸水、乙腈-水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水共5种流动相体系，结果表明，乙腈-0.1%磷酸水作为流动相时能够获得较好的分离效果，分析时间为15 min，且药材中无其他色谱峰的干扰。

3.2 检测波长的选择

实验中对检测波长进行了考察，二极管阵列检测器可进行全波长扫描，并可获得所测成分的最大吸收波长，有助于待测物的检测。实验中发现：桂皮酸的吸收峰位于290 nm，为最大吸收波长。综合考虑杂质色谱峰影响、基线、色谱峰峰形、最大吸收等因素，最终选择290 nm作为检测波长。

3.3 黄芪桂枝五物汤和桂枝水提物中桂皮酸含量比较

通过对6批黄芪桂枝五物汤和桂枝水提物中桂皮酸含量进行测定，结果发现，相比于桂枝水提物，黄芪桂枝五物汤中桂皮酸的含量减少，即配伍以后合煎液中桂皮酸的含量低于单煎液，也就是说黄芪桂枝五物汤中桂皮酸的提取减弱。课题组前期研究表明，相比于黄芪水提物，黄芪桂枝五物汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量明显增加，有正向促进作用。综合本实验与其他文献研究结果可以看出：在某些情况下，配伍可促进有效成分的溶出，也可能抑制有效成分的溶出，具体的机制仍有待进一步研究。

综上，本研究建立了一种快速、准确、灵敏的UFLC法测定黄芪桂枝五物汤和桂枝水提物中桂皮酸的含量。结果表明，黄芪桂枝五物汤相比于桂枝水提液中桂皮酸的含量减少，可为黄芪桂枝五物汤的进一步研究与开发提供参考依据。