吴连连，秦滢，胡安康

（徐州医科大学，江苏 徐州 221004）

癫痫是一种以大脑异常放电为特征的神经系统疾病，伴随着大脑内部一系列显著的变化，如海马功能障碍，主要表现为神经退行性变、神经发生异常等［1］。姜黄素是一种小分子多酚化合物，主要提取自姜科植物的根茎，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多方面的药理作用［2］，被广泛应用于多种疾病的防治。研究显示姜黄素在脑缺血和外伤性脑损伤中具有显著的神经保护的作用［3－4］。本研究旨在探究姜黄素对海仁藻酸（kainic aciq，KA）诱导的癫痫海马神经损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级C57/BL6雄性小鼠45只，10～12周龄，体质量20～22 g，由徐州医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（苏）2020－0011。在温度20～25 ℃，相对湿度50%～60%、灯光12 h/12 h 昼/夜控制的SPF 环境中饲养，小鼠能自由摄食及饮水。

1.2 试剂与仪器

KA、BrdU、姜黄素（美国Sigma－Aldrich 公司）；尼氏染色液（碧云天生物技术有限公司）；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（红色荧光）（大连美仑生物技术有限公司）；大鼠抗BrdU 抗体、兔抗Cleaved Caspase－3 抗体、山羊抗大鼠IgG H&L（FITC）（英国Abcam 公司）；兔抗Bax 抗体、兔抗Bcl－2 抗体（美国proteintech公司）；IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG（H+L）（VICMED公司）；徕卡冰冻切片机（CM1950）；日本OLYMPUS 正置荧光显微镜（BX53）；美国Li－Cor 公司的Odyssey CLX双红外激光成像系统。

1.3 癫痫模型制备

45 只小鼠随机分为模型组、对照组和姜黄素组3组，每组15只。模型组小鼠腹腔注射KA（25 mg/kg）建立癫痫模型，KA 提前用生理盐水溶解配置成1 mg/mL的浓度；对照组腹腔注射等量的生理盐水；姜黄素组小鼠在KA 给药前12 h 按400 mg/kg 剂量腹腔注射姜黄素，姜黄素提前用少量DMSO 助溶。观察3 组小鼠行为变化，根据Racine 分级标准［5］进行评价。Racine 分级标准：0 级，行为正常；Ⅰ级，面部肌肉痉挛，表现为眨眼、咀嚼、动须运动等以及湿狗样颤动；Ⅱ级，颈部肌肉痉挛，表现为点头运动；Ⅲ级，单侧前肢阵挛；Ⅳ级，站立伴有双前肢阵挛；Ⅴ级，身体失去平衡倒下，四肢持续抽动。小鼠症状达到Ⅲ级及其以上，且连续发作30 min 以上时，可视为癫痫造模成功；发作达1 h 给与10%水合氯醛腹腔注射以终止发作。

1.4 尼氏染色

癫痫造模后24 h，小鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉（0.35 mL/100 g），打开胸腔暴露心脏，经左心室插入灌注针，灌注4 ℃生理盐水，待肝、肺脏颜色转白，右心室流出的液体澄清无血时，灌注4%多聚甲醛直至小鼠身体变硬，断头取脑，多聚甲醛中固定过夜，替换至30%蔗糖中脱水直至脑组织沉底。进行冰冻切片，切片厚10 μm。4 ℃冰冻切片经4%多聚甲醛固定15 min，蒸馏水洗涤2 次，再次换新鲜蒸馏水洗涤2 次，尼氏染色液室温染色10 min，经蒸馏水洗涤2 次，过95%乙醇约5 s，70%乙醇洗涤2 次，封片晾干后显微镜下观察拍照。

1.5 TUNEL染色

切片经4%多聚甲醛固定，室温下30 min，PBS 缓冲液洗涤3次。用PBS按照1∶100的比例稀释Proteinase K（2 mg/mL），使其终浓度为20 μg/mL，每个组织样本滴加稀释好的Proteinase K，室温孵育10 min 后经PBA洗涤。滴加TUNEL 检测液于37 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤后封片，在荧光显微镜下观察拍照。

1.6 Western blot法检测

海马组织加入适量的蛋白裂解液，匀浆器匀浆，静置15 min，4 ℃，8 000 rpm × 20 min 离心，吸取上清。BCA法测定蛋白浓度，加入相应量的4×SDS上样缓冲液，沸水煮5 min 处理蛋白。等量蛋白样品经10%SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分离后，用湿转法转移至NC 膜上。经5%BSA 封闭后加入抗体，Cleaved Caspase－3 抗体（1∶1 500），Bax 抗体（1∶500），Bcl－2 抗体（1∶500），4 ℃孵育过夜。洗涤后加入相应的二抗（1∶5 000），室温避光孵育1 h；洗膜。Odyssey激光成像系统扫描，结果以图像处理仪分析处理。

1.7 BrdU免疫荧光染色

先配制好10 mg/mL 的BrdU 溶液，按预设的时间点给各组小鼠进行BrdU 腹腔注射。给药剂量为每次50 mg/kg，腹腔注射6 次，每12 h 给1 次，连续3 d，最后一次注射24 h 后灌注固定取脑。小鼠经4%多聚甲醛灌注固定，取脑，固定过夜。经30%蔗糖脱水沉糖，进行冰冻切片，切片厚20 μm，先以2 mol/L的HCl溶液处理使DNA 变性，于37 ℃放置30 min，以pH 值8.5 的0.1 mol/L 硼酸在室温环境中和10 min，10%山羊血清室温封闭40 min，滴加一抗，BrdU 抗体（1∶500），4 ℃孵育过夜。滴加荧光二抗（1∶100）孵育1.5 h，封片并于荧光显微镜下观察拍照。

1.8 统计学分析

利用图像分析软件和Photoshop 5.0 软件（Adobe）对图像进行处理，所有资料用SPSS 16.0 统计软件处理，以均数± 标准差（±s）表示，组间均数比较用单因素方差分析（One－Way ANOVA），两组比较用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 癫痫模型评估

根据癫痫发作等级标准，模型组小鼠癫痫发作达到3 级及以上的有14 只，只有1 只未达3 级；姜黄素组发作等级达3 级的有4 只，11 只未达3 级。经t检验分析，差异有统计学意义（F= 38.34，P= 0.009 7）。见表1。

表1 各组癫痫小鼠判定结果（只）

2.2 尼氏染色评定神经元损伤

尼氏染色结果显示，与对照组比较，模型组小鼠海马CA1 和CA3 区的神经元出现显著损伤，神经元数量显著减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，姜黄素组CA1 和CA3 神经元损伤减轻，神经元数量显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1，表2。

表2 各组尼氏染色CA1区和CA3区神经元数量比较（±s）

表2 各组尼氏染色CA1区和CA3区神经元数量比较（±s）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。

组别对照组模型组姜黄素组n4 4 4 CA1区74.00±3.47 41.00±2.10a 69.00±3.72b CA3区126.00±6.36 88.00±3.87a 115.00±7.12b

图1 各组海马CA1区和CA3区尼氏染色结果

2.3 TUNEL染色检测海马细胞凋亡

TUNEL 染色标记海马凋亡的神经细胞，结果显示对照组海马CA1 区和CA3 区均出现少量凋亡神经细胞，模型组CA1 区和CA3 区凋亡神经细胞数量较对照组显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，姜黄素组凋亡细胞数显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图2，表3。

图2 各组海马CA1和CA3区TUNEL染色结果

表3 各组CA1区和CA3区TUNEL阳性细胞数量比例比较（±s，%）

表3 各组CA1区和CA3区TUNEL阳性细胞数量比例比较（±s，%）

注：与对照组比较，aP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.05。

组别对照组模型组姜黄素组n4 4 4 CA1区9.48±0.45 33.10±2.33a 16.54±1.02b CA3区9.16±0.76 44.22±2.87a 23.71±2.17b

2.4 凋亡蛋白表达水平

模型组海马凋亡蛋白Cleaved Caspase－3 和Bax蛋白相对表达量显著高于对照组，抗凋亡蛋白Bcl－2相对表达量显著低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）；姜黄素组凋亡蛋白Cleaved Caspase－3 和Bax 蛋白相对表达量显著低于模型组，抗凋亡蛋白Bcl－2 相对表达量显著高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图3，表4。

图3 Western blot检测各组海马组织凋亡蛋白

表4 各组蛋白相对表达量的比较（±s）

表4 各组蛋白相对表达量的比较（±s）

注：与对照组比较，aP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.01。

组别对照组模型组姜黄素组n4 4 4 Cleaved Caspase－3 0.19±0.01 0.71±0.04a 0.26±0.02b Bax 0.12±0.01 0.74±0.30a 0.17±0.02b Bcl－2 0.46±0.03 0.10±0.01a 0.41±0.02b

2.5 BrdU染色检测海马细胞增殖

经BrdU 荧光染色标记DG 区新增殖细胞，结果显示与对照组比较，模型组DG 区BrdU 阳性细胞数显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）；姜黄素组BrdU阳性细胞数量显著低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图4，表5。

图4 各组DG区BrdU荧光染色图

表5 各组DG区BrdU阳性细胞数的比较（±s）

表5 各组DG区BrdU阳性细胞数的比较（±s）

注：与对照组比较，aP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.05。

组别对照组模型组姜黄素组n4 4 4 BrdU阳性细胞数30.00±2.10 98.00±4.55a 51.00±3.98b

3 讨论

姜黄素是从姜黄中提取的一种膳食多酚，具有抗氧化、抗炎、抗微生物感染、抗肿瘤、抗衰老等药理作用，已被证明在肿瘤、代谢性疾病、动脉粥样硬化、肠炎等多种疾病中具有治疗作用［6］。近年来，姜黄素对一些中枢神经退行性疾病的保护作用已在体内和体外研究中得到证实。

癫痫是一种慢性神经系统疾病，常伴有反复发作。癫痫发作会引起大脑结构和功能的改变，其病理机制仍未确定。一些基于诱发性癫痫模型的实验研究发现姜黄素可以延缓或完全抑制癫痫发作［7］。海马是癫痫发作后的易损区，其形态学变化主要表现为CA1 区和CA3 区锥体细胞的不同程度的受损和凋亡，神经元数的大量减少［8］。并且，在颞叶癫痫患者海马中也出现海马神经元丢失的情况，以CAl 区和CA3 区丢失最显著［9］。Caspase－3 是在细胞凋亡中起关键作用的调节蛋白，属于凋亡执行者。当接受到凋亡信号时会被剪切成有活性的Cleaved Caspase－3，导致核DNA 链断裂，细胞结构解体，出现细胞死亡［10－11］。此外，Bcl－2与Bax 也是凋亡过程中的一对功能相互对立的重要基因，可作为Caspase－3的上游调控基因，协助完成细胞凋亡的调控行为［12］。

本研究通过KA 诱导小鼠癫痫急性发作模型，观察了姜黄素在癫痫引起的海马损伤中的作用，发现癫痫发作后海马CA1 区和CA3 区出现明显的神经元丢失损伤，凋亡细胞数显著增加，而姜黄素治疗组却能极大地改善此种现象，神经元数和凋亡细胞数都趋于正常。模型组海马Cleaved Caspase－3 和Bax 表达显著上升，Bcl－2蛋白表达出现明显下调，姜黄素组凋亡蛋白表达趋于正常水平。以上实验结果表明，姜黄素可以减轻癫痫造成的海马神经元损伤和凋亡。

神经发生伴随在整个生命过程中，是神经干细胞增殖分化，新的神经元不断生成并整合到海马体回路的过程，对维持正常的生理功能至关重要。然而，在病理条件下会形成异常神经发生，产生异常的神经回路导致脑功能障碍［13－14］。癫痫发生是在癫痫损伤的最初阶段发生的过程，不仅涉及神经元损伤凋亡，还会出现神经发生增加［15］。对啮齿动物的研究表明，癫痫发作可促进齿状回亚颗粒带（SGZ）的细胞增殖和神经发生［16－17］。这种神经前体细胞增殖可能有助于异常神经回路的形成。在本实验中，以BrdU 标记新增殖细胞，结果显示模型组SGZ 区增殖细胞数显著增多，与以往报道一致，提示癫痫发作导致异常神经发生。姜黄素组细胞增殖活性显著降低，接近对照组，表明姜黄素可以抑制癫痫海马异常神经发生。

本实验研究结果表明，姜黄素能减少癫痫海马神经元损伤和凋亡，抑制神经发生，这提示姜黄素对癫痫发作引起的一系列海马损伤能起到一定的保护作用。