吴越，张恬，李笑，张秀园，刘炬，2✉

（1.山东中医药大学，山东 济南 250013；2.山东省千佛山医院，山东 济南 250014）

视网膜血管炎（retinal vasculitis，RV）是以视网膜血管的炎症性改变为主的疾病，其主要表现为视网膜血管扩张，血管周围有黄白色炎性渗出或白鞘，且伴有脉络膜、玻璃体的眼后段炎症反应［1］。目前视网膜血管炎的发生机制尚不明确，大多认为与自身免疫反应有关。细胞焦亡是一种炎症性、程序性细胞死亡方式［2］。它主要通过炎症小体介导多种半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）激活，导致多种Gasdermin 家族成员发生剪切和多聚化，引发细胞膜孔道形成，释放细胞内容物和成熟的炎症因子至胞外，并扩大炎症级联反应，例如白细胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）、白细胞介素－18（interleukin－18，IL－18）等［2］。Gasdermin D（GSDMD）是Gasdermin 家族中研究广泛的成员之一，也是焦亡过程中的执行者［3］。研究表明，IL－1β 等细胞因子驱动炎症改变，对视网膜微血管内皮细胞造成损伤，导致糖尿病视网膜病变［4］、白塞病［5］的标志性血管病变。已有研究表明［6］，焦亡在自身免疫性疾病中发挥作用。因此，焦亡可能是视网膜血管炎的发生机制之一。

近年来，临床上治疗视网膜血管炎常使用糖皮质激素、免疫抑制剂、激光手术等疗法。然而，这些疗法存在治疗周期长、毒副作用大且价格昂贵等不足。中医学从整体观念出发，对视网膜血管炎进行辨证论治并取得良好的临床疗效。复方血栓通胶囊是由三七、丹参、黄芪和玄参四味中药构成的中成药制剂，在活血化瘀、保护视网膜血管结构［7］、改善微循环［8］、抗炎［9］等方面具有突出疗效，且价格适中。在临床上，常用来治疗糖尿病视网膜病变［9］、黄斑水肿［10］、视网膜静脉阻塞［11］、青光眼［12］等疾病。目前，复方血栓通胶囊对视网膜血管炎的治疗作用及其机制尚未见有文献报道，复方血栓通胶囊是否通过焦亡介导的炎症反应改善视网膜血管炎尚需进一步的研究。

本实验通过建立小鼠视网膜血管炎模型，观察复方血栓通胶囊对视网膜血管炎的治疗作用，并探讨其治疗视网膜血管炎的作用机制，为临床治疗提供更多生物靶点和用药依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级雄性8周龄C57BL/6小鼠60只，体质量20～25 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号：20210927Abzz0619000395。正常饲料喂养，12 h昼夜交替7 d后进入实验。本动物实验经山东省千佛山医院伦理委员会批准进行（编号：QFSYY20210006）。

1.2 药品与试剂

复方血栓通胶囊（广东众生药业股份有限公司，批号：210215）；醋酸泼尼松片（天津天药药业股份有限公司，批号：2011143）；复方托吡卡胺滴眼液（沈阳兴齐眼药股份有限公司，批号：200801）；氧氟沙星眼膏（沈阳兴齐眼药股份有限公司，批号：210302）；人IRBP（1－20）肽（美国Med Chem Express 公司，批号：298202－25－2）；百日咳毒素（北京博蕾德科技发展有限公司，批号：181242A1）；完全弗氏佐剂（美国Sigma 公司，批号：9007812）；4%多聚甲醛通用型组织固定液（北京兰杰柯科技有限公司，批号：69111800）；苏木素染色剂（北京索莱宝科技有限公司，批号：ZH190905）；伊红染色剂（北京索莱宝科技有限公司，批号：XH184205）；RNA 组织/细胞快速提取试剂盒（TIAN GEN 公司，批号：W9928）；4 × g DNA wiper Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：7E581k1）；5×HiScript®ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：7E542I1）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：027E2222BA）；GSDMD（Affinity Boisciences 公 司，批号：AF4012）；Caspase－1（Proteintech 公司，批号：22915－1－AP）；Cleave－IL－1β（Affinity Biosciences 公 司，批号：38c0979）；吐温－20（Solarbio 公司，批号：923V011）；Pierce™BCA 蛋白检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，批号：UJ290653）；小鼠白介素（IL－1β）酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号：E－MSEL－M0003）。

1.3 仪器

小动物视网膜成像系统（Optoprobe，型号：Opto－Ris Pro）；普通台式离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：micro17＆21）；光学显微镜（Primotech，型号：蔡司ZEISS）；显微镜（Olympus，型号：CX33）；超声波破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：JY96－IIN）；生物病理切片机（济南童鑫生物科技有限公司，型号：QPJ－1C）；制冰机（Ziegra，型号：ZBE 70－35）；Milli－Q®台式纯水系统（Merck，型号：ZIQ7003T0）；Western blot 凝胶电泳系统（Bio Rad，型号：164－5052）；超灵敏多功能成像仪（GE，型号：Amersham Imager 680）；PCR 扩增仪（Bio－Rad，型号：T100）；实时荧光定量PCR 仪（Bio－Rad，型号：CFX96）；移液器（Eppendorf，型号：3120 000.283）；漩涡振荡器（其林贝尔，型号：VORTEX-5）；酶标仪（Thermo Fisher，型号：1510）。

2 方法

2.1 动物分组与造模

将8 周龄60 只雄性C57BL/6 小鼠在温度25 ℃，湿度50%～70%实验室规范下饲养，自由饮水进食。将小鼠随机分为5 组：空白组（Control）、模型组（Model）、复方血栓通低剂量组（FXST－L）、复方血栓通中剂量组（FXST－M）和复方血栓通高剂量组（FXST－H）。待小鼠活动稳定后，对Model、FXST－L、FXST－M、FXST－H 组小鼠进行麻醉，将人IRBP1－20 肽溶液（100 μL，5 mg/mL）与完全弗氏佐剂（100 μL，含5 mg/mL结核分枝杆菌）1∶1 混匀并充分乳化，再将200 μL 的白色乳剂分别在Model、FXST－L、FXST－M、FXST－H组小鼠的头颈部、左右大腿根部及尾根部皮下注射；给予Control 组小鼠等容积的生理盐水进行皮下注射造模。在进行主动免疫造模后，再向Model、FXST－L、FXST－M、FXST－H 组小鼠皮下注射免疫佐剂百日咳毒素（100 μL，5 μg/mL）；给予Control 组小鼠等容积生理盐水进行腹腔注射。

2.2 动物给药及处理

造模24 h 后，各组小鼠灌胃给药，频率为每日1次，灌胃容积均为0.02 mL/g。其中，Control、Model组灌胃0.02 mL/g 蒸馏水；FXST－L、FXST－M、FXST－H组分别为灌胃0.6、1.2、2.4 g/kg 复方血栓通溶液。21 d 后，各组取2 只小鼠利用小动物视网膜成像系统观察小鼠视网膜组织病理变化。其余小鼠腹腔注射40 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉处死并摘取小鼠眼球。各组小鼠的右眼球用PBS 冲洗，迅速置入眼球固定液中备用，左眼球置于显微镜下分离视网膜，液氮保存备用。

2.3 活体眼底照相

采用小动物视网膜成像系统，取各组2 只小鼠，腹腔下注射进行全身麻醉，麻醉后再固定小鼠。采用复方托吡卡胺滴眼液给小鼠眼球散瞳，氧氟沙星眼膏保护角膜免受强光损害。调整小动物视网膜成像系统进光角度，进行小鼠活体眼底照相。

2.4 HE染色法观察小鼠视网膜组织的病理变化

首先，将眼球固定液固定后的小鼠右眼球进行石蜡包埋。沿角膜－视神经轴方向，用生物病理切片机将石蜡块切成6 μm厚的切片移至载玻片上。然后，将石蜡切片常规脱蜡水化，进行苏木素－伊红（HE）染色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂胶封片。最后，在显微镜下观察小鼠眼底视网膜及玻璃体腔的组织结构病理改变、炎性细胞浸润情况。

2.5 RT－PCR法检测各组小鼠视网膜组织Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA表达水平

将小鼠视网膜组织分离后，使用Omega 总RNA 提取试剂盒提取小鼠视网膜组织RNA，用HiScript®ⅢRT SuperMix for qPCR（+ gDNA wiper）进行逆转录，之后用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 进行实时荧光定量PCR，使用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

2.6 Western blot 法检测各组小鼠视网膜组织中Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β蛋白表达情况

提取各组小鼠视网膜组织蛋白后，将制备的蛋白样品通过BCA法进行蛋白浓度测定，依次进行蛋白变性、制备12.5%凝胶、蛋白上样、恒压电泳、恒流转膜、脱脂牛奶封闭、一抗Caspase－1（1∶1 000）、GSDMD（1∶1 000）、Cleave－IL－1β（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）稀释后孵育、二抗（1∶10 000）稀释后孵育抗原抗体反应、显影曝光、拍照等步骤。

2.7 ELISA 法检测各组小鼠血清中IL－1β 的表达水平

提取各组小鼠眼眶血后，低温3 000 rpm 离心15 min，分离血清。根据小鼠白介素（IL－1β）酶联免疫吸附测定试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪于450 nm 处进行吸光度测定，绘制标准曲线，计算出血清IL－1β水平。

2.8 统计学方法

数据统计采用GraphPad Prism 8.0统计软件处理，以±s表示，采用one－way ANOVA进行统计分析，P ＜0.05代表差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠视网膜组织的血管变化

给药21 d后，利用小动物视网膜成像系统观察小鼠眼底视网膜组织的血管变化。结果发现，Control组小鼠视网膜血管自视盘发出，呈放射状分枝形态，血管径直，血管周围无炎症浸润。与Control组比较，Model组小鼠视盘边缘模糊，可见弥漫性或局限性浸润；视网膜血管可见静脉增粗变形，血管中有白色袖带广泛浸润；部分血管被遮挡，袖带的尺寸大于血管直径；此外，视网膜组织可见孤立性和线性病变。与Model组比较，FXST－L、FXST－M、FXST－H 组的病理情况均有改善。其中，FXST－H组的改善效果最为突出，其视网膜血管径直且逐渐均匀变细，无迂曲扩张病变。见图1。

图1 视网膜成像系统观察各组小鼠视网膜组织的血管变化

3.2 小鼠视网膜组织的病理变化

给药21 d 后，利用HE 染色法观察小鼠视网膜组织的病理变化。结果发现，Control 组视野中视网膜各层结构清晰，厚薄均匀，未见其他明显异常。与Control组比较，Model 组视野中视网膜增厚，内外颗粒层厚薄不均，细胞排列不规则（黑色箭头），内网状层及内界膜以内可见较多粒细胞为主的炎性细胞浸润（红色箭头）。与Model 组比较，FXST－L、FXST－M、FXST－H组的病理变化有明显改善。其中FXST－L 组视野中视网膜增厚，内外颗粒层厚薄不均，细胞排列不规则（黑色箭头），局灶性的结构紊乱（黄色箭头），内网状层及内界膜以内可见较多粒细胞为主的炎性细胞浸润（红色箭头）。FXST－M 组视野中神经节细胞层可见少量血管扩张（黑色箭头）。FXST－H 组视野中各层结构清晰，厚薄均匀，仅见炎性细胞浸润，其余未见明显异常。见图2。

图2 HE染色法观察各组小鼠视网膜组织的病理变化（HE，×200）

3.3 各组小鼠视网膜组织中Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA的表达水平

结果发现，与Control 组比较，Model 组小鼠视网膜组织中Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA 的相对表达量显著升高，差异具有统计学意义（P ＜0.01）。与Model比较，FXST－L、FXST－M、FXST－H组Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA 的相对表达量显著下降。其中，FXST－H组中Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA 的相对表达量下降较为明显，差异具有统计学意义（P ＜0.01）。见图3。

图3 各组小鼠视网膜组织中Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA的相对表达比较情况

3.4 各组小鼠视网膜组织中Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β的蛋白表达水平

与Control 组比较，Model 组小鼠视网膜组织中GSDMD－N、Caspase－1、IL－1β的蛋白相对表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与Model组比较，FXST－M 组小鼠视网膜组织中Caspase－1、GSDND－N、IL－1β 的蛋白相对表达水平降低。其中，FXST－H组小鼠视网膜组织中Caspase－1、GSDND－N、IL－1β的蛋白水平明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图4、图5。

图4 各组小鼠视网膜组织中Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β的蛋白表达情况

图5 各组小鼠视网膜组织中Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β 蛋白相对表达比较情况

3.5 各组小鼠血清中IL－1β的表达水平

与Control 组比较，Model 组小鼠血清中IL－1β 的表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与Model 组比较，FXST－L、FXST－M 组小鼠血清中IL－1β 的表达水平降低。其中，FXST－H 组小鼠血清中IL－1β 的水平明显下降，差异具有统计学意义（P ＜0.01）。见图6。

图6 各组小鼠血清中IL－1β的表达情况

4 讨论

视网膜血管炎（RV）是以视网膜中血管炎症为主要病变的疾患，常伴有脉络膜、玻璃体的眼后段炎症反应［1］。本病好发于20～40 岁青壮年［13］，既可以单独发病［14］，也可以是全身性疾病的眼部临床表现［15-16］。视网膜血管炎病因和发病机制复杂，并且易反复发作，给患者及家庭带来严重的身心负担。临床最常用的治疗药物是皮质类固醇联合免疫抑制剂，但治疗周期长，长期使用会引起全身严重并发症，毒副作用大且易复发。由于本病难以治愈，病情往往随时间延长而加重。因此，目前本病研究中急需解决的重要问题是寻求特异且有效的治疗方法。

视网膜血管炎属“络损暴盲”范畴［17］，该病名首见于《临床必读》。以络损暴盲而论，肝郁、痰凝所致之气滞血瘀，或气逆、气虚所致之血不归经，皆可产生血络破损病理变化与瘀血病理产物。《素问·至真要大论》云：“坚者削之，结者散之，留者攻之”，故见瘀血积滞，先逐其瘀血。复方血栓通胶囊是经现代萃取工艺制成的中成药制剂。方中选用活血化瘀之三七为君药，破瘀生新而辅君之丹参为臣药，大补元气之黄芪和滋阴明目之玄参为佐药，合用则具化瘀生新、活血养目之效。研究表明，复方血栓通胶囊具有促纤溶、抗血栓，增加微循环灌注，改善血液流变学的黏、浓、聚状态，调节脂质代谢［11，18-19］的药理作用。通过网络药理学分析［8］，筛选出复方血栓通胶囊改善微循环的活性成分41 个，潜在作用靶点40 个，主要通过血管、免疫炎症、神经活性、糖尿病相关通路发挥作用。随着中医药研究的不断深入，复方血栓通胶囊已经成为治疗眼底血管性疾病的重要药物之一。本实验建立小鼠视网膜血管炎模型，观察到复方血栓通胶囊可有效改善视网膜组织的病理变化，FXST－H 组可明显缓解小鼠眼底中血管以及视网膜组织中的病理变化，血管周围炎症浸润减轻，验证了复方血栓通胶囊可有效改善视网膜组织的炎症病理，但其机制尚不清楚。

当不同病原体感染宿主时，焦亡可作为宿主的一种防御机制，激活天然免疫系统来抵抗微生物的入侵。在焦亡过程中，炎症小体激活Caspase－1/4/5/11 信号通路。激活的Caspase－1/4/5/11 将IL－1β、IL－18 剪切为成熟形式，并水解GSDMD 蛋白氨基端形成有活性的N端结构（N－terminal domain，GSDMD－N）［3］。GSDMD－N具有脂溶性，能特异性地结合细胞膜形成膜孔道［20］。细胞内容物和成熟的炎症因子（IL－1β、IL－18）从膜孔中流出引发细胞焦亡。已有研究表明，焦亡在感染性疾病［21］、自身免疫性疾病［6］、心血管性疾病［22］以及肿瘤［23］等疾病中发挥作用。以上研究提示，小鼠视网膜血管炎可能与焦亡相关，而复方血栓通胶囊是否通过焦亡介导的炎症反应改善视网膜血管炎尚需进一步的研究。

在本实验中，笔者检测了不同组别视网膜组织中GSDMD、Caspase－1、IL－1β mRNA 和Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β蛋白表达水平，血清中IL－1β的含量。结果显示，与Control 组比较，Model 组视网膜组织中GSDMD、Caspase－1、IL－1β mRNA 和Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β蛋白表达水平、血清中IL－1β的含量均明显升高，以上结果表明视网膜血管炎中存在焦亡的炎症表达；与Model组比较，FXST－H 组视网膜组织中Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA 和Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β 蛋白表达水平、血清中IL-1β 的含量均显著降低，以上结果表明复方血栓通胶囊能缓解视网膜血管炎中焦亡的炎症表达。

综上所述，复方血栓通胶囊可有效改善视网膜血管炎的病理变化，其机制可能是通过抑制Caspase－1/GSDMD 焦亡通路降低炎症反应，最终达到治疗作用。本研究阐述了复方血栓通胶囊对小鼠视网膜血管炎焦亡的作用及机制，为视网膜血管炎治疗提供了有效靶点和用药依据。