李周瑜，杨欣，张迎，石昌菊，金继华

（贵州中医药大学基础医学院，贵州 贵阳 550025）

结肠癌是世界上第二大癌症，病死率高，存活率低，严重威胁人类健康，主要由大肠内层恶性赘生物引起［1］。目前，结肠癌发病率呈逐年上升状态，临床上主要采用传统的化疗、放疗和外科手术结合中药辅助治疗，但在化疗过程中使用的抗肿瘤药物不仅抑制、杀灭肿瘤细胞，对正常细胞也具有破坏作用［2］。由于现阶段缺乏有效的早期诊断手段，多数病人发现时已经为结肠癌晚期并发生转移，几乎无法手术根治，使结肠癌患者的预后变差。结肠癌的发展涉及多阶段、多因素，受原癌基因或肿瘤抑制基因的共同影响［3］。

随着多学科的相互交叉，肿瘤基础检测水平不断提高，内源性小分子中基因与蛋白表达的变化规律可以通过代谢组学、基因组学、蛋白质组学等现代科学技术进行监测，以帮助人们对癌症有更好的认知，从而提高对于癌症的预防、诊断和治疗能力［4］。TCGA 是目前最大的癌症基因信息数据库，相比GEO 数据库其优势是具有规范的临床数据，不只展现在多种癌型上，还包括基因表达数据、miRNA 表达数据、DNA 甲基化和SNP 等［5］。本研究首先采用网络药理学的方法筛选出结肠癌的关键靶点，基于TCGA 数据库分析关键靶点TP53、MYC、VEGFA、JUN、MMP9、TNF 和EGFR 基因在结肠癌患者中的表达状态；采用GEPIA 数据库对TP53、MYC、VEGFA、EGFR、MMP9、JUN 基因进行Kaplan－Meier 生存分析和Log－rankP检验；选择与结肠癌预后相关的基因VEGFA 和EGFR 探讨其与临床分期和多种临床病理特征的关系；采用COX 比例风险回归模型对与临床病理相关的基因VEGFA 进行单因素和多因素分析。揭示VEGFA 基因在结肠癌中的表达及临床意义，为进一步探讨VEGFA 在结肠癌发生、发展和预后中的作用提供理论依据。

1 资料及方法

1.1 数据库与软件

TCGA数据库（https：//cancergenome.nih.gov/）；STRING（https：//stringhttpsdb.org/）；Commparative Toxicogenomics Database（http：//ctdbase.org/）；Cytoscape 3.5.1软件（http：//www.cytoscape.org）；GEPIA（http：//gepia.cancerhttpspku.cn/）。

1.2 结肠癌靶点筛选

通过CTD（Commparative Toxicogenomics Database）筛选结肠癌的潜在靶标基因，通过疾病名称（Colonic Neoplasms）或疾病ID（D003110）进行在线筛选，选择marker/mechanism（M）或者therapeutic（T）的靶标为研究对象。

1.3 GO（Gene Ontology）功能分析

结肠癌靶点GO 功能分析基于DAVID 6.8（DAVID 6.8，https：//david.ncifcrf.gov/）在线分析，将174个靶点导入DAVID 数据库，限定物种为人源，设定阈值P＜0.01，GO（Gene Ontology）注释分析包含生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）以及分子功能（molecular function，MF）。

1.4 结肠癌Hub靶点筛选

基于Cytoscape 3.5.1 软件中的CytoHubba 模块筛选结肠癌的Hub靶点。包括连接度（degree）、边缘渗出组件（edge percolated component，EPC）、最大邻居组件（maximum neighborhood component，MNC）、最大邻居组件的密度（density of maximum neighborhood component，DMNC）、最大团中心性（maximal clique centrality，MCC）、瓶颈值（bottleneck，BN）、偏心度（EcCentricity）、紧密度（closeness）、发散性（radiality）、中介性（betweenness）、应力（stress），本研究基于Degree、MNC、MCC和Stress四种算法输出Hub基因［6-7］。

1.5 收集TCGA数据库中表达数据

TCGA 数据库（Access TCGA Data）下载结肠癌患者基因表达谱数据（mRNA），基因表达谱数据已进行lg2（x+1）转化。基于perl 合并数据，删除数据缺失及差异较大的样本，确定473 例结肠癌样品和41 例正常样品，分析TP53、MYC、VEGFA、EGFR、MMP9、JUN 和TNF 基因在结肠癌患者中的表达状态，所有数据均使用R软件处理（V3.5.1）。

1.6 统计学方法

采用R 3.5.1 软件进行统计学分析，以mRNA 表达量的中位数为节点，将基因表达定义为高表达组和低表达组，用点图对TCGA－结肠癌（COAD）数据集患者的TP53、MYC、VEGFA、EGFR、MMP9、JUN 和TNF表达进行评价。采用GEPIA（http：//gepia.cancer－pku.cn/）数据库用Kaplan－Meier 分 析TP53、MYC、VEGFA、EGFR、MMP9 和JUN 基因表达量与COAD 预后的相关性［8］。根据TCGA 数据库的临床数据，分析VEGFA 和EGFR 基因在不同等级COAD 组织中的mRNA 表达水平，探讨其与COAD 临床分期和多种临床病理特征的关系。单因素分析和多因素分析采用Cox比例风险回归模型，P＜0.05代表差异具有统计学意义。

1.7 薏苡仁的干预研究

薏苡仁化合物基于TCMSP 下载化学结构，采用SYBYL 对小分子进行Minimize 能量最小化优化，获得合理构象。采用药物分子设计模拟SYBYL 2.1.1软件的Surflex－Dock 模块完成分子对接研究。从蛋白质晶体结构数据库RCSB（http：//www.rcsb.org/pdb）获取VEGFA蛋白晶体结构（PDB ID：5T89）。

2 结果

2.1 结肠癌靶点GO注释分析

选择已经有实验验证的“M”或“T”为靶标，共筛选出174个结肠癌的靶标基因。GO（Gene Ontology）注释结果见图1，174 个靶点主要参与negative regulation of apoptotic process（凋亡过程的负调节）、positive regulation of gene expression（基因表达的正调控）、positive regulation of protein phosphorylation（蛋白磷酸化的正调控）和positive regulation of cell proliferation（细胞增殖的正调控）等生物过程；174 个靶点主要分布在extracellular space（细胞外间隙）、cytosol（胞质溶胶）、extracellular exosome、nucleoplasm（核质）和cytoplasm（细胞质）等；174 个靶点主要有enzyme binding（酶结合）、transcription factor binding（转录因子结合）、protein binding（蛋白质结合）、protein kinase binding（蛋白激酶结合）和chromatin binding（染色质结合）等分子功能。见图1。

2.2 结肠癌Hub靶点分析

174 个结肠癌靶点通过STRING 进行相互作用分析，基于Cytoscape 3.5.1 中的CytoHubba 中的Degree、MNC、MCC和Stress四种算法输出前10个Hub基因，见图2。采用FunRich 3.0 软件绘制结肠癌Hub 靶点的韦恩图，通过取交集的方法获取7 个Hub 靶点：肿瘤坏死因子（TNF）、p53 肿瘤蛋白（TP53）、原癌基因MYC 蛋白（MYC）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）、基质金属蛋白酶－9（MMP9）和转录因子AP－1（JUN）。

图2 关键靶标筛选

2.3 关键基因在结肠癌组织和正常组织中的表达

TCGA 数据中删除临床信息和预后信息不完整样本，保留473 例结肠癌样品和41 例癌旁组织样品，将TP53、MYC、VEGFA、JUN、MMP9、EGFR、TNF mRNA 表达值平均分为2份，数值从小到大依次为低表达和高表达。TNF mRNA 表达值在结肠癌组织和正常组织中差异无统计学意义（P＞0.05）；TP53、MYC、VEGFA、JUN、MMP9 mRNA 表达值在结肠癌组织中显著高于正常组织（P≤0.01）；EGFR mRNA 表达值在结肠癌组织中显著低于正常组织（P＜0.01）。见图3。

图3 关键基因mRNA表达

2.4 关键基因的表达与结肠癌预后的关系

TNF mRNA 表达值在结肠癌患者中无统计学意义（P＞0.05），将不进行预后研究。为明确TP53、MYC、VEGFA、JUN、MMP9、EGFR 表达与结肠癌预后之间的关系。运用Kaplan－Meier 模型进行分析。TP53、MYC、VEGFA、JUN、MMP9、EGFR 表达水平在总生存率（overall survival，OS）中与结肠癌患者预后情况无关（Log－rankP＞0.05）；TP53、MYC、JUN、MMP9 表达水平在无病生存率（disease－free survival，DFS）中与结肠癌患者预后情况无关（Log－rankP＞0.05）；EGFR 表达水平在DFS 中与结肠癌患预后情况显著相关（Log－rankP= 0.036）；VEGFA 表达水平在DFS 中与结肠癌患预后情况显著相关（Log－rankP=0.016）。见图4。

图4 不同基因的总生存率和无疾病进展生存率

2.5 EGFR、VEGFA表达量与临床病理参数相关性

EGFR、VEGFA 基因表达与预后有一定相关性（P ＜0.05），将进一步探讨EGFR、VEGFA 表达量与COAD临床分期（stage）和T、N、M分期的相关性。临床分期结果显示：EGFR基因表达量与COAD临床分期无显著相关性（P=0.064）；VEGFA 基因表达量与COAD临床分期具有显著相关性（P=0.006）。见图5。T 分期、N 分期和M 分期结果显示：EGFR 基因的表达量与T 分期、N 分期和M 分期无显著相关性；VEGFA 基因的表达量与N 分期呈显著正相关，N1 和N2 期COAD 组织中VEGFA的基因表达量显著高于N0期（P ＜0.05）。见图6。

图5 EGFR、VEGFA基因表达量与COAD临床分期的相关性

图6 EGFR、VEGFA基因表达与COAD临床病理特征的相关性

2.6 影响结肠癌患者预后的单因素和多因素分析

EGFR 基因的表达量与临床病理参数相关性差异不显著（P＞0.05），将不进行预后的单因素分析和多因素分析。故本研究只进行VEGFA 在结肠癌患者中表达的单因素和多因素分析。单因素回归分析发现，年龄、临床分期及T、N、M 分期能够影响患者的预后（P＜0.05），VEGFA 表达状态和性别对预后没有明显影响。见表1。以上因素纳入COX 多因素回归分析，结果提示年龄、T 分期是影响结肠癌患者预后的独立因素（P＜0.05）。

表1 VEGFA在结肠癌患者中表达的单因素分析和多因素分析

2.7 分子对接

通过TCGA 分析发现VEGFA 与结肠癌发生、发展和预后关系密切，基于TCMSP 下载薏苡仁化学成分38 个，其中16 个化学成分与VEGFA 有较好的结合（T_Score ＞5），薏苡仁内酯与VEGFA 的结合分数最高，为6.6。见表2。

表2 化学成分与VEGFA分子对接结果

3 讨论

本次研究分析了来自TCGA 数据库的结肠癌mRNA 数据，共纳入514 例样本。根据VEGFA mRNA的中位表达量，将研究对象分为VEGFA 高表达及低表达两组。主要分析结肠癌中VEGFA 表达与临床病理及预后的关系。VEGFA mRNA 在结肠癌组织中高表达，其表达量与N分期呈正相关，进一步揭示了结肠癌患者VEGFA 表达量与预后的关系，绘制Kaplan－Meier 生存函数曲线，结果提示VEGFA mRNA 高表达组与低表达组DFS 的差异均有统计学意义（P＜0.05）。单因素分析发现，年龄、临床分期及T、N、M 分期能够影响结肠癌患者的预后（P＜0.05），性别和VEGFA 表达状态与结肠癌患者预后无相关性（P＞0.05）；COX 多因素回归分析结果提示，年龄、T 分期是影响结肠癌患者预后的独立因素（P＜0.05）。

结肠癌的发生、发展过程，包括肿瘤生长、侵袭和转移，与血管的生成密切相关，其过程中多种因子参与的信号通路起到一定作用［9］。VEGFA 表达水平在DFS中与结肠癌患预后情况显著相关。VEGFA 又称为血管通透因子，是血管生长因子VEGF 的一类重要亚型，为血管生成促进因子，影响器官的发育、创伤愈合、组织再生、内皮细胞生长和血管渗透等［10］。有研究表明在结肠癌患者中VEGFA 过表达与血管生成以及肿瘤的生长、转移密切相关［11］，而且有研究发现，很多实体瘤中VEGFA/VEGFR2信号可以诱导肿瘤的血管生成，其中包括结直肠癌、肝癌、乳腺癌和胃癌等［12-13］，也有一些抑制剂Vatalanib、Cabozantinib、Foretinib 能够通过抑制VEGF的表达，控制肿瘤血管生长的过程［14-16］。本研究揭示VEGFA 基因在结肠癌中的表达及临床意义，为进一步探讨VEGFA 在结肠癌发生、发展和预后中的作用提供理论依据。

目前，结肠癌患者死亡多数与复发和转移相关。但是临床上结肠癌的靶向治疗处于初级阶段，因此，掌握结肠癌的发生、发展的生物学特征及关键靶点，可更好地为开发抗结肠癌药物提供理论依据。本研究对TCGA 数据库进行数据挖掘，揭示VEGFA 基因在结肠癌中的表达及临床意义，为进一步探讨VEGFA在结肠癌发生、发展和预后提供理论依据。但是，本研究研究的样本量数量有限，仅mRNA 水平探讨VEGFA 基因在结肠癌患者中的表达及预后作用，后期将进一步采用蛋白印记或免疫组化在蛋白水平上进行深入研究。