刘芮奇，李灵常，崔莉，孙娥✉

（1.南京中医药大学第三临床医学院，江苏 南京 210028；2.江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028）

结肠癌是我国常见的恶性肿瘤，近年来，我国结肠癌的患病率和病死率逐年增加。最新中国癌症统计报告显示，结肠癌患病率在恶性肿瘤中位居第三，病死率在恶性肿瘤中位居第五［1］，其中新发病例37.6万例，死亡病例19.1 万例，已经严重威胁到人们的生命健康。结肠癌的早期症状不明显，发现时多是中晚期［2］，因此，深入研究结肠癌的防治具有重要意义。目前临床上常用于治疗结肠癌的化疗药物有奥沙利铂、氟尿嘧啶、伊立替康和卡培他滨等，但是较强的胃肠道副作用和神经毒性严重影响患者的生活质量。

中药治疗结肠癌不但能抑制结肠癌细胞增殖，抑制诱发结肠癌基因表达，抑制转移瘤生长，还能提高患者免疫力，改善结肠癌术后不良反应［3］。复方肠泰方是江苏省中西医结合医院霍介格教授的经验方，由人参、黄芪、藤梨根、八月札、苦参、薏苡仁组成，长期应用于临床治疗结肠癌。前期研究发现，与单纯FOLFOX4方案化疗相比，复方肠泰方联合FOLFOX4可减轻化疗引发的毒性，从而提高治疗效果［4-5］。复方肠泰方还具有抗小鼠结肠癌血管生成作用［6］。本研究进一步探讨复方肠泰方是否可通过诱导结肠癌细胞产生自噬，实现促癌细胞死亡的作用。

自噬又被称作Ⅱ型程序性死亡，在多种癌症中发挥作用，通过促进致癌分子的降解，最终阻止癌症的发展［7］。参与自噬调节的主要通路包括Akt/mTOR/p70S6K 信号通路和Ras/Raf－1/（MEK1/2）/（ERK1/2）通路，两者都与肿瘤发生密切相关［8］。本文将研究复方肠泰方对CT26细胞增殖和自噬的影响，并探讨其产生自噬是否与Akt/mTOR/p70S6K 信号通路有关，为复方肠泰方的进一步开发与应用提供理论基础。

1 材料

1.1 细胞株

小鼠结肠癌CT26细胞，购自美国模式菌种收集中心（ATCC），保存于江苏省中医药研究院中药制剂研究室。用含10%胎牛血清的RPMI－1640 不完全培养液于37 ℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。

1.2 实验药物及试剂

RPMI－1640 不完全培养液（批号：20210114）、胰蛋白酶（批号：20200731）、MTT 细胞增殖检测试剂盒（20210705）、细胞自噬染色检测试剂盒（批号：20210312），均购自江苏凯基生物技术股份有限公司；四季青无噬菌体低内毒素优级胎牛血清（南京基远生物科技有限公司，批号：21020702）；雷帕霉素（上海碧云天生物技术有限公司，批号：092220201231）；人参、黄芪、藤梨根、八月札、苦参、薏苡仁均由江苏省中西医结合医院中药房提供，经江苏省中医院黄然主管中药师鉴定，均符合相关标准；抗体LC3（批号：BS－8878R）、Beclin－1（批号：BSM－33323M）、Akt1+2+3（批号：BS－6951R）、mTOR（批号：BS－1992R）、p70S6K（批号：BS－1426R）、p－Akt（批号：BSM－33281M），均购自北京博奥森生物技术有限公司；pmTOR（武汉博士德生物工程有限公司，批号：BM4840）；p－p70S6K（美国CST公司，批号：9234T）。

1.3 主要仪器

电子天平（瑞安市英衡电器有限公司，YHC1002）；调温电热套（北京市光明医疗仪器有限公司，DZTW）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，RE－5203）；真空灭菌锅（广州市深华生物技术有限公司，GI80DP）；数显恒温搅拌循环水箱（常州国华电器有限公司，HH－60）；生物安全柜（苏州赛默飞世尔仪器有限公司，1300 系列Ⅱ级）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂，TDL－40B）；倒置显微镜（重庆光电仪器有限公司，XDS－1B）；CO2细胞培养箱（Thermo Forma 公司，HERAcell150）；-80 ℃冰箱（Thermo Forma 公司，-86 ℃ULT Freezer）；荧光倒置显微镜（南京奥力科学仪器有限公司，Olympus Ⅸ73）；透射电镜（日本电子株式会社，JEM－1400）；酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司，Spectra max 190）。

2 方法

2.1 复方肠泰方的制备

复方肠泰方处方：人参9 g，黄芪15 g，藤梨根15 g，八月札9 g，苦参6 g，薏苡仁20 g。用10 倍体积水浸泡药材0.5 h，大火煮沸后小火煎煮1 h，药液趁热经100目筛网过滤，滤渣再加8 倍体积水煎煮1 h，过滤，放冷，合并两次滤液，旋转蒸发仪浓缩至生药量为2.5 g/mL。用培养基稀释复方肠泰方溶液，超声30 min，10 000 r/min 离心10 min，上清液用0.22 μm 无菌滤膜过滤除菌。

2.2 MTT法检测细胞存活率

在96 孔板中，设置空白对照组以及不同浓度复方肠泰组（10、20、40、70、80、90 mg/mL），每组6 个复孔。将CT26 细胞以5×103个/孔的数量接种于96 孔板中，置于37 ℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。待细胞生长至80%密度，吸出原培养基，加入100 μL 不同浓度药物。培养24 h 后每孔加入50 μL MTT 溶液，在37 ℃下孵育，4 h 后MTT 还原为甲臜。吸出上清液保留底部蓝紫色结晶，每孔加入150 μL DMSO，平板摇床摇匀10 min 使甲臜充分溶解。酶标仪在490 nm 波长处检测每孔吸光度。

2.3 透射电镜观察细胞中自噬体

CT26 细胞以2×105个/孔的数量接种于6 孔板中，细胞长到80%汇合度后，吸出原培养基，加入80 mg/mL复方肠泰方溶液孵育24 h。培养基终止消化，2 000 r/min离心2 min，弃细胞上清。PBS洗涤3次后转移至1.5 mL EP 管中，离心去除PBS。轻轻加入1 mL 2.5%戊二醛，室温固定至少2 h，然后进行包埋固化切片，3%醋酸铀－枸橼酸铅双染色，透射电镜观察细胞中自噬体并拍照记录。

2.4 MDC法检测细胞中自噬体

用MDC 法对自噬体进行染色。24 孔板中放入与其等体积的细胞爬片，CT26 细胞以5 × 104个/孔的数量接种于24 孔板中，细胞长到80%汇合度后，吸出原培养基。设置空白对照组以及低、中、高浓度（20、40、80 mg/mL）复方肠泰组，干预细胞24 h。弃原培养液，加入300 μL 1 × Wash bufffer 洗2 次，然后每孔加入100 μL MDC 工作液，室温避光染色30 min 后弃染液，每孔加入300 μL 1 × Wash bufffer 洗3 次。取出爬片，

有细胞一面滴20 μL 抗荧光淬灭剂，盖玻片封片，荧光显微镜下观察细胞被染色情况并拍照记录。

2.5 自噬诱导剂雷帕霉素

设置空白对照组、80 mg/mL 复方肠泰组和复方肠泰+雷帕霉素组。将CT26 细胞以5 × 103个/孔的数量接种于96 孔板中，每组6 个复孔。待细胞生长至80%汇合度，复方肠泰+ 雷帕霉素组用自噬诱导剂50 nmol/L 雷帕霉素与80 mg/mL 复方肠泰方溶液共同干预细胞，孵育24 h后，用荧光倒置显微镜拍摄不同组的细胞状态。然后使用MTT 法评估CT26 细胞的存活率。

2.6 蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白表达

CT26 细胞以1×105个/孔的数量接种于6 孔板中，细胞长到80%汇合度后，吸出原培养基，分别加入低、中、高浓度（20、40、80 mg/mL）复方肠泰方溶液孵育。24 h 后用胰酶消化细胞，培养基终止消化，2 000 r/min离心2 min，PBS洗涤3次，去上清得细胞沉淀。加入沉淀体积5 倍的裂解液，将沉淀吹散，4 ℃裂解1 h，超声破碎仪破碎，10 000 r/min 离心10 min，收集上清液。BCA 法用于确定蛋白质量浓度，将上样液于100 ℃水中煮沸5 min 使蛋白质变性，冰上骤冷，SDS－PAGE 电泳分离后转移至PVDF 膜上，转膜结束后，用5%脱脂奶粉将膜封闭2 h，封闭后，与一抗在4 ℃下孵育过夜，回收一抗，二抗室温摇床振荡反应2 h。ECL 发光显色。

2.7 统计学方法

采用Graphpad Prism 6 统计软件处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析（One－way ANOVA），两组间比较采用t检验，P＜0.05代表差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 CT26细胞增殖情况比较

不同浓度复方肠泰方溶液（10、20、40、70、80、90 mg/mL）处理CT26细胞24 h后，MTT检测结果显示，与空白对照组相比，10、20、40 mg/mL 浓度的复方肠泰方对细胞增殖影响较小。当复方肠泰方浓度增至80 mg/mL 时，细胞存活率为50%左右，且随着浓度的增加，增殖抑制效果增强。见表1。为确保复方肠泰方对CT26 细胞有增殖抑制作用且能进行后续实验相关指标的检测，故选用低、中、高剂量的复方肠泰方溶液（20、40、80 mg/mL）进行后续研究。

表1 各组对CT26细胞增殖的抑制作用比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05，***P ＜0.001，****P ＜0.000 1。

组别空白对照组复方肠泰组浓度（mg/mL）0 10 20 40 70 80 90存活率（%）100.00 93.62±4.12 95.53±6.71 96.30±5.08 72.53±3.98*47.04±2.37***29.78±0.65****

3.2 CT26细胞产生自噬情况比较

透射电镜结果见图1，与空白对照组相比，80 mg/mL 浓度的复方肠泰方溶液干预细胞后可以看到类似自噬溶酶体结构，放大后能看到自噬体中被降解的细胞器。MDC 使自噬体在荧光显微镜下发出蓝绿色荧光，结果见图2。低、中、高剂量复方肠泰方溶液干预CT26细胞后，细胞荧光强度显著增强，50 nmol/L雷帕霉素组细胞荧光强度最高。自噬体只是检测自噬的单一指标，为进一步验证复方肠泰方是否诱导CT26细胞产生自噬，使用蛋白质印迹法检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin－1 蛋白表达水平，结果见图3、表2。与空白对照组相比，中、高剂量复方肠泰方溶液干预CT26 细胞后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达升高。Beclin－1 蛋白表达随复方肠泰方给药浓度增加而增加（P＜0.05），说明复方肠泰方可以诱导CT26产生自噬。

表2 CT26细胞自噬相关蛋白表达的比较（±s）

表2 CT26细胞自噬相关蛋白表达的比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别空白对照组复方肠泰组浓度（mg/mL）0 20 40 80 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.82±0.04 0.69±0.06 0.90±0.07 0.88±0.03 Beclin－1/GAPDH 0.40±0.08 0.74±0.10*0.86±0.13**1.01±0.18**

图1 透射电镜观察CT26细胞内自噬溶酶体

图2 MDC染色法检测CT26细胞自噬体（×200）

图3 不同浓度复方肠泰方对CT26细胞自噬相关蛋白表达的影响

3.3 自噬诱导CT26细胞存活率情况比较

雷帕霉素可通过抑制mTOR通路，诱导和促进细胞自噬的发生。用自噬诱导剂雷帕霉素干预细胞，用倒置显微镜观察细胞生存状况，结果见图4。空白对照组细胞伸展良好，边界清晰；80 mg/mL浓度复方肠泰干预后，贴壁细胞数减少，细胞少量皱缩，少数细胞从伸展状态变为圆形状态；80 mg/mL浓度复方肠泰+50 nmol/L浓度雷帕霉素干预后，细胞皱缩严重，贴壁细胞数少。MTT法检测CT26细胞存活率，结果与空白对照组相比，复方肠泰方抑制了CT26细胞增殖，复方肠泰+雷帕霉素使CT26细胞的病死率增加。见表3。

图4 自噬诱导剂对复方肠泰方作用的CT26细胞形态的影响（×100）

表3 自噬诱导CT26细胞存活率的比较（±s）

表3 自噬诱导CT26细胞存活率的比较（±s）

注：与空白对照组比较，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

组别空白对照组复方肠泰组复方肠泰+雷帕霉素组浓度（mg/mL）0 80 80存活率（%）100.00 57.30±5.22**26.31±2.18***

3.4 对Akt/mTOR/p70S6K通路影响的比较

采用蛋白质印迹法检测Akt/mTOR/p70S6K通路的相关蛋白表达。结果发现，p－Akt、p－mTOR和p－p70S6K与自噬呈负相关。与空白对照组相比，低、中、高剂量复方肠泰干预CT26细胞后，p－Akt/Akt、p－mTOR/mTOR和p－p70S6K/p70S6K的蛋白表达降低（P＜0.05）。结果表明复方肠泰方可能通过抑制Akt/mTOR/p70S6K通路，诱导CT26细胞产生自噬。见表4、图5。

图5 不同浓度复方肠泰方对CT26细胞Akt/mTOR/p70S6K通路相关蛋白表达的影响

表4 各组对CT26细胞Akt/mTOR/p70S6K通路相关蛋白表达的影响（±s）

表4 各组对CT26细胞Akt/mTOR/p70S6K通路相关蛋白表达的影响（±s）

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别空白对照组复方肠泰组浓度（mg/mL）0 20 40 80 p－Akt/Akt 0.99±0.13 0.75±0.07*0.38±0.03**0.17±0.01**p－mTOR/mTOR 0.77±0.07 0.80±0.02 0.59±0.15 0.24±0.09*p－p70S6K/p70S6K 1.33±0.16 0.76±0.08*0.55±0.06*0.26±0.02**

4 讨论

结肠癌属“肠覃”“肠癖”“脏毒”等范畴［9］。中医学认为，结肠癌的形成是由于人体正气不足，外邪侵袭脾胃，导致脾失健运，气血津液运行失常，水湿停聚，积久形成瘀、毒、湿热。故治疗结直肠癌应以补益气血、驱邪外出为原则，以健脾益气、化瘀解毒为治疗方法［10］。复方肠泰方按照健脾益气、化瘀解毒的治疗原则，由人参、黄芪、藤梨根、八月札、苦参、薏苡仁组成。方中人参补脾益肺、扶正培本；薏苡仁健脾宁心、利水渗湿；黄芪补气、益卫固表；苦参泻火解毒；藤梨根清热解毒、祛风除湿；八月札疏肝理气、活血止痛。全方配伍，共奏补益正气、健脾利湿、清热解毒、活血化瘀之功。一方面直接补益正气提高人体免疫力，另一方面驱除损害人体正气的病邪［11］。

复方肠泰方的抗癌作用可能是通过抑制癌细胞的增殖实现的。实验表明，10 ～60 mg/mL复方肠泰方对细胞的增殖作用影响较小，细胞存活率在90%左右。但当复方肠泰方浓度增至70 mg/mL 时，细胞存活率降至70%，且随着浓度的增加，增殖抑制作用增强。

本研究进一步探索了复方肠泰方抑制癌细胞增殖是否与自噬相关，结果发现，复方肠泰方干预CT26细胞后，可观察到自噬小体和自噬相关蛋白表达的增加。仅中、高剂量的复方肠泰方增加了CT26 细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平，提示复方肠泰方的浓度与自噬的发生密切相关，今后仍需在后续研究中扩大复方肠泰方浓度范围来继续探索其诱导自噬的规律。自噬已被确定为肿瘤细胞存活和抵抗的潜在机制，一方面可以阻止致癌蛋白如p62 以及受损蛋白和细胞器的积累起到抑制肿瘤作用［12］，另一方面，在晚期肿瘤或癌症治疗期间，自噬可以作为细胞防御机制发挥作用，使肿瘤细胞能够在缺氧和代谢应激等恶劣条件下存活［13］。这说明自噬对肿瘤细胞的作用具有双重性，自噬既可以诱导细胞死亡又可以在缺氧等恶劣环境下促使肿瘤细胞存活。然而复方肠泰方诱导CT26细胞产生的自噬与肿瘤细胞死亡的关系尚不明确，因此笔者采用自噬诱导剂雷帕霉素干预CT26细胞，结果发现复方肠泰+雷帕霉素组细胞存活率为26%，而复方肠泰组细胞存活率为57%，两者差异具有统计学意义，提示诱导产生的自噬促进了CT26细胞的死亡。综上，复方肠泰方可通过诱导CT26细胞产生自噬，促使细胞死亡，从而达到抗结肠癌作用。

自噬相关通路可调控细胞增殖、生长、代谢和运动。PI3K 激酶是最上游的分子，作为自噬信号级联的触发器，磷酸化Akt 能抑制TSC1/2 导致mTORC1 激活［14］。mTORC1通过磷酸化使形成的自噬调节复合物失活，从而抑制自噬小体的发生。p70S6K 靶点作为mTOR 的下游，可以被mTOR 通路激活。因此Akt/mTOR/p70S6K 通路与自噬的发生密切相关，通过抑制此通路调节自噬可为多种疾病的治疗提供策略［15］。研究表明，小檗碱可以通过抑制mAPK/mTOR/p70S6K 信号通路诱导细胞抑制性自噬，从而抑制人胃癌细胞的体内、外生长［16］。红景天苷通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人大肠癌细胞凋亡和自噬［17］。本研究同样发现，复方肠泰方干预CT26细胞后，Akt、mTOR 和p70S6K 蛋白的磷酸化水平降低。说明复方肠泰方可能通过抑制Akt/mTOR/p70S6K 通路诱导结肠癌细胞发生自噬。

综上所述，复方肠泰方可通过抑制Akt/mTOR/p70S6K 通路诱导结肠癌细胞自噬，进而抑制癌细胞增殖，发挥抗结肠癌作用，本研究可为临床开发治疗结肠癌确有疗效的复方制剂奠定基础。