张越 综述 韩宇 审校

近年来，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs），尤其是程序性细胞死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）及其配体1（programmed cell death protein-ligand 1，PD-L1）单抗，已被广泛应用于多种实体癌的治疗中。根据近几年NCCN 指南以及中国临床肿瘤学会（CSCO）指南的变化显示，在晚期胃/胃食管结合部肿瘤（gastric/gastroesophageal junction cancer，GC/GEJC ）中，无论HER2 表达状态如何，ICIs 的地位越来越高，覆盖范围也越来越广，从三线治疗逐渐升级到一线治疗。

目前针对晚期胃癌一线行ICIs 联合化疗的临床研究中，pembrolizumab 联合化疗（顺铂+5-氟尿嘧啶/卡培他滨）在KEYNOTE-059 研究中展现了较好的抗肿瘤活性[1]，但该方案在KEYNOTE-062 研究未能显示出优于化疗的生存获益[2]。针对部分亚洲人群的ATTRACTION-4 研究在HER2 阴性晚期GC/GEJC患者中使用nivolumab 联合SOX/XELOX（奥沙利铂+替吉奥/卡培他滨）显著改善了无进展生存期（progression-free survival，PFS），但未改善总生存期（overall survival，OS）[3]。但nivolumab联合XELOX/FOLFOX（奥沙利铂+5-氟尿嘧啶+亚叶酸钙）在另一项全球大型Ⅲ期研究CheckMate-649 中疗效达到双主要终点，实现OS、PFS 双获益[4]，对比全球人群，中国亚组人群从nivolumab 联合化疗的一线治疗方案中的获益更显著[5]。除此之外，其他几种PD-1/PD-L1 单抗如sintilimab（NCT03745170）[6]、toripalimab（NCT02915432）[7]、tislelizumab（NCT03469557）[8]及CS1001[9]分别联合化疗在晚期胃癌患者的一线治疗中也显示出了良好的疗效。在HER2 阳性的晚期GC 中，Ⅱ期的PANTHERA 研究[10]和NCT02954536[11]，以 及Ⅲ期的KEYNOTE811[12]使用pembrolizumab 联合曲妥珠单抗和化疗也显著改善了患者的临床疗效。目前针对晚期胃癌ICIs 联合化疗的多项研究正在进行中，例如NCT03675737、NCT03813784、NCT03777657、NCT-03802591 等。

晚期胃癌一线行免疫检查点抑制剂联合化疗的客观缓解率（overall response rate，ORR）已达较高水平，仍有一部分人群不能从中获益，且3～4 级治疗相关不良事件（treatment-related adverse event，TRAE）发生率仍较高。因此，确定精确的生物标志物来识别ICIs 联合化疗的优势人群是临床上亟需解决的问题。

1 HER2 阳性晚期胃癌

HER2 又称ERBB2，属于表皮生长因子受体家族，位于人类第17 号染色体（17q21）上，HER2 通过形成异二聚体和酪氨酸激酶自身磷酸化介导信号转导，从而激活下游通路，参与细胞有丝分裂和影响细胞增殖和凋亡。目前，HER-2 表达与胃癌预后的关系尚不清楚，HER2 阳性胃癌的定义标准为免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）3+或IHC 2+加上荧光原位杂交法阳性，胃癌HER2 阳性率为7.3%～20.2%[13]。曲妥珠单抗联合化疗是HER2 阳性晚期GC/GEJC 的标准一线治疗方案。研究表明，曲妥珠单抗可以介导免疫细胞释放与IFN-γ 的分泌，从而上调PD-L1 表达[14]。

一些小样本研究将pembrolizumab 加入抗HER2联合化疗方案中，无论PD-L1 表达状态如何，HER2阳性晚期胃癌患者的ORR 及OS 进一步改善[10-11]。随后，2021 年美国临床肿瘤学会（ASCO）会议上公布了大型Ⅲ期KEYNOTE-811 研究的中期分析结果，针对未经治疗HER2 阳性晚期胃癌患者，在标准一线方案的基础上联合pembrolizumab 使ORR 提高22.7%（P=0.000 06），两组的ORR 分别为74.4% 和51.9%，缓解持续时间（duration of response，DOR）延长（10.6个月vs.9.5 个月），但目前PFS 及OS 的结果尚未公布，值得期待[12]。同年在欧洲肿瘤内科学会（ESMO）大会上公布了Stein 等[15]的研究结果，在该研究的B组（曲妥珠单抗+nivolumab+FOLFOX）中，PD-L1 CPS≥1 和≥5 人群的ORR 分别为65% 和68%，中位PFS均为11 个月，中位OS 分别为21.8 和22.4 个月，提示在HER2 阳性晚期胃癌患者中，PD-L1 表达与PD-1 单抗联合化疗治疗疗效相关性较弱，可能是由于HER2 对于靶向+化疗+免疫治疗疗效的预测价值权重更高，从而掩盖了PD-L1 表达的预测价值。

在HER2 阳性晚期胃癌中，抗HER2 治疗联合化疗的基础上再增加免疫治疗观察到了良好的近期抗肿瘤活性及可控的安全性，但是否可以延长生存期有待进一步验证，并且尚未发现有价值的疗效预测生物标记物。此外，对于不适合化疗的患者能否“去化疗”及其相关的生物标记物仍需进一步研究。

2 HER2 阴性晚期胃癌

2.1 错配修复缺陷/高度微卫星不稳定

DNA 的修复过程需要四种错配修复基因（即MLH1、MSH2、PMS2 和MSH6）的参与，基因功能缺失时将导致错配修复缺陷/高度微卫星不稳定（different mismatch repair/microsatellite instability-high，dMMR/MSI-H）的发生。MSI-H/dMMR发生在肿瘤细胞中，产生高突变负荷并形成大量免疫原性新抗原，使大量免疫细胞浸润，在这种环境下有助于ICIs 发挥主导作用[16]。

MSI-H/dMMR 是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的第一个与肿瘤类型无关的免疫检查点抑制剂疗效相关生物标志物。据报道，MSI-H/dMMR 在胃癌中发生率为10%～20%[17]。对KEYNOTE-062 中对MSI-H/dMMR 患者进行回顾性分析，发现MSI-H/dMMR 的晚期胃癌化疗疗效最差，ORR 为36.8%，OS仅为8.5 个月，pembrolizumab 单药或联合化疗均显著优于化疗，ORR 分别为57.1% 和64.7%，OS 均为未达到（not reached，NR），提示pembrolizumab 在MSIH/dMMR 的晚期胃癌患者中可获得较好的疗效[18]。在CheckMate-649 研究中的MSI-H/dMMR 人群，免疫联合化疗组对比化疗组OS 大幅延长（38.7 个月vs.12.3 个月），ORR 也明显提高（55%vs.39%），与微卫星稳定型（microsatellite stability，MSS）人群相比，MSI-H 人群生存获益更显著，OS 的HR 分别为0.38和0.78，同时nivolumab+ipilimumab 组对比化疗组，观察到MSI-H 患者有更长的OS（NRvs.10 个月，HR=0.28）和更高的ORR（70%vs.57%），此外，还发现PD-L1 表达与MSI-H/dMMR 无相关性，两者具有独立的预测价值[4,19]。总之，MSI-H/dMMR 在晚期胃癌ICIs 治疗中有着显著的预测价值，但人群所占比太小，现有证据应用于临床实践还存在一些争议，目前尚缺乏大型随机对照试验对MSI-H/MSS 晚期胃癌患者使用ICIs 进行分层研究，多为亚组分析或回顾性研究，另一个关键性问题是，针对MSI-H 的晚期胃癌该如何选择具体的免疫治疗方案，仍需继续观察。

2.2 PD-L1 表达

PD-L1 是一种跨膜蛋白，也称为CD274 或B7-H1。肿瘤细胞和（或）肿瘤浸润免疫细胞上表达的PDL1 与活化T 细胞上表达的PD-1 相互作用，导致免疫反应抑制，使肿瘤逃避免疫识别和破坏。由于PD-L1表达的数量在很大程度上影响其抑制免疫原性的能力，并进一步决定ICIs 的有效性，因此PD-L1 表达可以作为ICIs 治疗的预测生物标志物[20]。一般使用IHC方法通过不同的抗体来检测PD-L1 表达，不同抗体对应于不同的PD-1/PD-L1 抑制剂[21]。目前PD-L1 评估主要采用联合阳性评分（combined positive score，CPS）和肿瘤比例评分（tumor proportion score，TPS），TPS仅评估了PD-L1 在肿瘤细胞中的表达，而CPS 评估了肿瘤微环境中所有PD-L1 的表达，不仅反映肿瘤的恶性潜能，也反映了宿主的免疫状态[20]，并且多项研究结果表明，CPS 评分对比于TPS 评分，能更好地预测晚期胃癌免疫治疗的疗效及预后[1,4]。

CheckMate-649 研究结果的公布，实现了ICIs 联合化疗在晚期胃癌一线治疗中的重大突破。在PDL1 CPS≥5，CPS≥1 的人群中使用nivolumab 联合化疗生存获益更显著，PFS 分别为7.7、7.5 个月，疾病进展风险分别下降32%和26%，OS 分别14.4、14.0 个月，死亡风险分别下降29% 和23%[4]。该研究提示，CPS 的评分越高，患者使用nivolumab 联合化疗的疾病进展风险及死亡风险均呈递减趋势。然而，在整个研究人群中，CPS≥5 的患者比例为60%，高于既往报道（17%～50%），这可能影响了CPS≥1 患者和所有随机患者的获益程度。Zhao 等[22]对CheckMate-649 研究和KEYNOTE-062 研究中PD-L1 低表达人群进行生存分析，发现在CheckMate-649 研究中CPS=1～4（OS：HR=0.95，P=0.678；PFS：HR=0.96，P=0.743）和KEYNOTE-062 研究中CPS=1～9（OS：HR=0.84，P=0.141；PFS：HR=0.92，P=0.510）的人群中，联合组对比化疗组的OS 和PFS 无显著差异，提示在PD-L1 低表达的晚期胃癌中，ICIs 联合化疗对比化疗未能增加额外的OS 或PFS 获益优势，但这一结论有待验证。2021 年ESMO 年会公布的ORIENT-16 研究的中期分析结果为sintilimab 联合化疗在中国晚期胃癌一线治疗中提供了有效的价值，对比于总体人群的OS（15.2个月vs.12.3个月，HR=0.77；P=0.009）和PFS（HR=0.64，P＜0.000 1），在CPS≥5 的晚期胃癌患者，使用sintilimab 联合化疗OS（18.4 个月vs.12.9 个月，HR=0.66；P=0.002 3）和PFS（HR=0.63，P=0.000 2）更能从中获益，这部分人群中ORR 更高（72.8%vs.59.6%）[6]（表1）。

表1 PD-L1 表达在晚期胃癌一线免疫检查点抑制剂联合化疗的主要研究

综上所述，多项临床研究证明了PD-L1 CPS≥5的人群中使用ICIs 联合化疗的优势，2022 年中国临床肿瘤学会（CSCO）指南已将nivolumab 或sintilimab 联合化疗在HER2 阴性CPS≥5 晚期胃癌患者的一线治疗中以1a 类证据作为推荐，在 HER2 阴性CPS＜5 晚期胃癌患者的一线治疗中也以1b 类证据作为推荐。但从目前来看，PD-L1 表达尚不能成为稳定的预测标志物，表达阴性人群亦可从ICIs 联合化疗的治疗中获益。此外，PD-L1 表达的检测及评估方法尚未标准化，PD-L1 表达在不同阶段呈动态变化趋势，具有时空异质性，检测结果可能会受到活检时间和组织来源的影响，同一肿瘤组织中，不同的活检部位也可能存在不同的PD-L1 的表达，且先前的治疗也会对其产生影响，仍需进一步优化[21]。

2.3 肿瘤突变负荷

肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）被定义为非同义单核苷酸变异的数量，通常表示为每Mb 的突变数（mut/Mb）。体细胞外显子区域的大量突变将导致新抗原产生增加，其中一些具有免疫原性，可以被T 细胞识别，从而引起抗肿瘤免疫反应，因此当TMB 越高，就越容易从ICIs 中获益。目前TMB 的检测方法主要是基于高通量测序平台的全外显子测序和靶向Panel 测序的拟合算法，前者被认为是评估TMB 的金标准，但由于其高成本和判断标准的限制，目前仅用于研究领域[16]。基于KEYNOTE-158 研究结果，组织TMB（tissue TMB，tTMB）可以作为一个预测pembrolizumab 单药治疗复发或转移性晚期实体瘤患者的疗效相关生物标记物，但实际上，tTMB 的应用仍面临着许多问题和争议。首先KEYNOTE-158 研究通过评估10 种不同罕见癌症（不包括胃癌）患者的tTMB 来分析其对ICIs 的疗效预测作用，并未评估和分析其他主要肿瘤类型及引起高突变表型的原因，其次以ORR 为主要研究终点，尚无生存或生活质量获益的证据，无法解释tTMB＜10 mut/Mb 的患者是否生存获益[23]。2020 年ESMO 大会报道了KEYNOTE-062 的探索性分析结果，在晚期胃癌一线治疗中，tTMB-H（≥10 mut/Mb）的患者对比tTMB-L 的患者使用pembrolizumab 的ORR 分别为56% 和7%，使用pembrolizumab 联合化疗的ORR 分别为73%和46%，并且在tTMB-H 的患者中，pembrolizumab 单药组及联合化疗组对比化疗组，疾病进展风险分别下降48%和38%，死亡风险分别下降66%和46%，证明tTMB与pembrolizumab 联合或不联合化疗在晚期胃癌一线治疗中的疗效具有相关性，但该研究没有排除MSI-H的患者，研究结果仍需进一步探讨[24]。此外，TMB 的定义是假设所有突变都可能产生新抗原，未考虑新抗原质量，且TMB 仅评估肿瘤，未考虑宿主免疫反应和肿瘤微环境[16]。一项研究发现，与单一生物标志物相比，TMB 联合T 细胞基因表达谱（gene expression profile，GEP）作为PD-1/PD-L1 抑制剂的疗效标志物具有更高的敏感性和更大的预测价值[25]。基线病变数量（Baseline lesion number，BLN）与TMB 的联合使用，也更有助于免疫治疗优势人群的选择[26]。TMB 很可能在未来成为组合标记的一个重要组成部分。

2.4 EB 病毒

EB 病毒（Epstein-Barr virus）相关胃癌（EBVaGC）是一种常见的与EB 病毒感染有关的恶性肿瘤，通过EBER（EBV 编码的一种小RNA）原位杂交进行检测。EBVaGC 约占全球所有胃癌的10%，具有DNA 超甲基化表型、PD-L1 和PD-L2 过度表达以及PIK3CA基因的频繁突变的特征，其独特的分子生物学特征表明将EBV 作为ICIs 疗效预测生物标志物的潜力[27]。一项韩国的Ⅱ期临床试验中，发现6 例EBVaGC 患者对pembrolizumab 的治疗反应良好，ORR 高达100%，中位缓解持续时间达8.5 个月[28]。然而，在另一项研究中，55 例晚期胃癌患者接受toripalimab 治疗，其中有4 例EBV 阳性，仅观察到1 例患者达到部分缓解（25%）[7]。尽管EBV与ICIs 治疗胃癌的良好疗效具有相关性，但由于目前的研究样本量较小，不同研究结果一致性较差，其确切的生物学机制尚未完全阐述等多种因素，使其在临床应用中受到限制，未来仍需进一步探讨。

3 其他潜在的生物标记物

3.1 肿瘤浸润性淋巴细胞及T 细胞受体

抗肿瘤免疫反应需要免疫系统中肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）的存在、激活和共同刺激，包括CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、B细胞和固有淋巴细胞等[29]。在多种实体肿瘤中，TILs的存在与更好的临床疗效和预后相关[30]。研究报道，EBV 阳性和MSI-H/dMMR 相关的胃癌组织中伴有较高的免疫细胞浸润，其与预后改善及对ICIs 的高应答相关[31]。根据PD-L1 的表达及TIL 的存在将肿瘤微环境分为4 种亚型，其中T2 型肿瘤（PD-L1+，TIL+）更可能从免疫治疗中获益，表明肿瘤微环境中大量T细胞的浸润是ICIs 发挥作用的潜在条件[32]。TILs 与ICIs 反应之间的关系较为复杂的，阐明每个淋巴细胞的精确预测作用至关重要，并且不同区域具有不同的T 细胞密度，导致结果可变。同时T 细胞的特异性由T 细胞受体（T-cell receptor，TCR）决定，基线TCR 的多样性和治疗后的克隆性增殖可以反映患者对ICIs治疗的反应，但目前的研究主要是针对黑色素瘤、非小细胞肺癌及乳腺癌等，且结果存在差异[33]。除此之外，TCR 受控于多种因素，例如肿瘤类型、ICIs 的类型，肿瘤突变负担和患者的免疫遗传学等，因此需要进一步研究。

3.2 微生物群

另一个正在进行的研究领域是关于微生物群与胃癌中ICIs 的临床反应之间的关系。在KEYNOTE-062 及CheckMate-649 研究中，使用ICIs 在亚洲人群的亚组分析的生存获益均优于北美洲和欧洲患者[2,5]。据统计，幽门螺杆菌感染率在亚洲患者中为54%～76%，在北美洲和北欧患者中分别为37.9% 和33%，亚洲的幽门螺杆菌感染率远高于西方国家，因此推测幽门螺杆菌感染可能是采用ICIs 治疗胃癌的潜在有利因素[34]。此外，另一个研究分析了76 例胃癌患者和85例食管癌患者接受ICIs 治疗的临床预后预测因素，在开始ICIs 前30 天接受抗生素治疗的患者中，观察到OS 降低[35]。目前微生物群是免疫治疗的探索性生物标志物，需要进一步确定微生物种类及其对免疫治疗的影响，从而预测免疫治疗疗效和辅助免疫治疗。

3.3 循环生物标记物

循环肿瘤DNA（circulating tumour DNA，ctDNA）是外周血液中肿瘤衍生的片段化DNA，可作为肿瘤负荷的代表。有研究证明，在胃癌中一线使用ICIs 联合化疗治疗后ctDNA 清除与生存获益相关[11,15]，动态ctDNA 可作为晚期胃癌免疫治疗反应的潜在生物标志物。最大体细胞等位基因频率（maximum somatic allele frequency,MSAF）用来反映ctDNA 释放的程度，当MSAF 较低时ctDNA 释放量较低，与良好的预后相关[36]，并且ICIs 治疗后MSAF 的下降与良好的疗效相关[37]。但该指标能否在临床应用有待进一步的优化及验证。除此之外，越来越多的证据表明，中性粒细胞与淋巴细胞比值可以作为一种有效的预后指标，并与各种实体肿瘤的ICIs 相关，因为大量表达PD-L1 的中性粒细胞可能与PD-1T 细胞结合从而减弱抗肿瘤反应[16]。外周血中的其他标志物，例如淋巴细胞和嗜酸性粒细胞计数，乳酸脱氢酶、C-反应蛋白和细胞因子等，也被证实与ICIs 反应相关，但由于其易受多种因素影响，需要继续探索和验证。

4 结语

随着ICIs 在晚期胃癌中的治疗地位的确立，如何通过生物标志物选择获益人群，是目前胃癌免疫治疗中的重要研究方向。目前，上述的疗效预测生物标记物在临床研究中的探索还存在许多不足，如治疗样本较小、研究方法不统一，结果存在假阴性，检测成本高等。尚需高质量、标准化的临床研究加以验证，单一的生物标记物不太可能精确预测疗效，未来开发多个生物标记物联合评估模式及预测模型的建立可能更能准确地确定免疫治疗优势人群。