王瑶 李佳璐 马焕 李鹍 王洪波 丁莹莹 陶海波 李梅

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，是导致青少年因癌症死亡的第二大因素[1-2]。骨肉瘤好发于股骨远端及胫骨近端，恶性程度高，转移率达20%[3]。自新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NAC）+广泛切除+术后化疗三阶段结合的综合治疗方法广泛应用以来，患者保肢率和5 年生存率均有较大提高，但仍有20%～30%的患者因对一线化疗方案不敏感而预后不佳，因此NAC 疗效已成为影响骨肉瘤患者手术方式选择和预后的重要因素[1-4]。肿瘤坏死率（tumor necrosis rate，TNR）是目前评价骨肉瘤NAC 疗效的病理学金标准，但因取材要求严格、操作繁琐且仅适用于行根治性手术的肿瘤，致使评估具有一定的滞后性[2,4-5]。动态增强磁共振成像(dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI) 是一项肿瘤灌注成像技术，可有效评估肿瘤微血管生成情况，为肿瘤疗效评估和转归预测提供有效信息。目前该技术已在脑胶质瘤[6]、乳腺癌[7-9]、结直肠癌[10]、下咽癌[11]、宫颈癌[12]、前列腺癌[13-14]、软组织肉瘤[15]等诸多恶性肿瘤的疗效评价研究中得到验证，但应用在骨肉瘤NAC 肿瘤坏死率评估中的报道极少。本研究旨在探讨DCE-MRI 评估骨肉瘤NAC 肿瘤坏死率的价值，以期尽早发现对治疗无反应或反应差的骨肉瘤病例，为临床治疗方案制定及调整提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2019 年1 月至2020 年6 月于昆明医科大学第三附属医院行手术病理证实的原发性骨肉瘤患者11 例，其中男性9 例，女性2 例，中位年龄17（11～32）岁；发生在股骨远端5 例，胫骨近端6 例。纳入标准：首次MRI 检查前均未行病理活检及相关治疗；无MRI 检查禁忌证，无化疗及手术禁忌证；按期完成NAC 并行第2 次MRI 检查，后行扩大根治术。化疗方案为AP、MTX+VCR、IFO 序贯化疗（AP=阿霉素（ADM）+顺铂（DDP）；MTX+VCR=甲氨蝶呤+长春新碱；IFO=异环磷酰胺）。MRI 影像资料均满足数据测量要求。本研究经昆明医科大学第三附属医院伦理委员会批准，入选患者均签署知情同意书。

1.2 影像学检查方法

所有患者在NAC 前及术前行2 次MRI 检查，采用Philips Ingenia 3.0T 磁共振仪（购自荷兰飞利浦公司）扫描，包括常规平扫及增强、DCE-MRI。DCEMRI 先采用扰相梯度回波序列（GRE）矢状位T1WI行两期反转角扫描，再使用扰相GRE 序列快速3D DYNAMIC 行矢状位T1WI 动态增强扫描。扫描参数：反转角度分别为5°、15°，TE 2.0 ms、TR 4.0 ms、层厚3.5 mm、间距0、FOV 250 mm×250 mm。对比剂注入前先扫描5 期，第5 期结束后团注对比剂（Gd-DTPA 0.1 mmol/kg，2.5 mL/s），共扫描80 期，采集1920 幅图像，总时间为6 m23 s。

1.3 病理组织定位取材及TNR 评估

患者完成NAC 并行第2 次MRI 检查后2 周内经手术取得完整瘤段，分别以髁间窝和髁间嵴中心为界，将瘤段沿正中矢状面剖开，选择一侧剖面切厚度为5 mm 的组织，将其分割为大小为1 cm×1 cm 若干组织块，组织块即为病理样本个体，依次进行编号、制备蜡块、HE 染色（图1A，图1B，图2A）。由1 名具有10 年以上工作经验的骨肿瘤病理医师独立判读HE 染色切片（图2C）。在100 倍镜下选取“热点”区域，400 倍镜下计数视野内TNR，选取5 个视野计数，最终结果取平均值。根据Huvos 分级标准分级所得样本TNR[5]。

1.4 DCE-MRI 影像处理分析

DCE-MRI 数据使用GE Healthcare 血流动力学Omni Kinetics（O.K.）软件进行测量及图像后处理。影像处理步骤：1）AIF 勾画：O.K.软件中手动勾画动脉输入函数（arterial input function，AIF），以扫描范围内股动脉为参考血管，勾画与血管截面大小相近的圆形ROI，勾画3～5 个ROI，获得多个AIF 并融合为最终AIF，保存该结果。2）ROI 勾画：选择瘤段切片对应的矢状位影像层面（图1C，图1D，图2B），计算定量DCE-MRI 结果，依次保存容量转移常数（volume transfer constant，Ktrans）、速率常数（rate constant，Kep）、血管外细胞外间隙容积分数（volume fraction，Ve）、血浆容积分数（plasma volume fraction，Vp）并生成参数伪彩图（图2D），按照瘤段分割出的组织块样本定位并等比例勾画大小为1 cm×1 cm 的ROI，测量各ROI内NAC 前、后2 次Ktrans、Kep、Ve、Vp值，同一个AIF 重复测量3 次后取平均值。

图1 病理取材及DCE-MRI 影像-病理匹配过程

图2 组织样本影像及病理表现

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。计量资料采用Shapiro-Wilk 和Levene 检验样本的正态性及方差齐性。不满足正态分布的参数采用Mann-WhitneyU检验，用中位数及四分位数间距表示。以TNR 评估肿瘤样本缓解视为阳性，绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic,ROC），评估不同参数的诊断效能，寻找最佳临界值，并计算其诊断敏感度和特异度。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤病理样本TNR 评估

11 例瘤段共取得病理样本357 个，排除H&E 染色证实非肿瘤及完全坏死样本53 个，共304 个病理样本纳入分析。根据Huvos 分级标准[5]，TNR Ⅰ级212 个（68.9%）；Ⅱ级37 个（12%），Ⅲ级31 个（10%），Ⅳ级28 个（9.1%）。缓解组TNR≥90%（Ⅲ级+Ⅳ级）共59 个，占总样本量19.4%；未缓解组TNR＜90%者（Ⅰ级+Ⅱ级）共245 个，占总样本量80.6%。

2.2 肿瘤病理样本NAC 前后，缓解组及未缓解组Ktrans、Kep、Ve、Vp 比较

NAC 前参数以pre-Ktrans、pre-Kep、pre-Ve、pre-Vp表示，化疗后以post-Ktrans、post-Kep、post-Ve、post-Vp表示，化疗前后参数差值以ΔKtrans、ΔKep、ΔVe、ΔVp表示。NAC 后，两组Ktrans、Ve、Vp均明显降低，且差异有统计学意义（P＜0.05）；缓解组Kep化疗后明显降低（P＜0.05），但未缓解组Kep较化疗前略有升高（P＞0.05），见表1。

表1 肿瘤病理样本缓解组及未缓解组NAC 前后参数比较

2.3 肿瘤病理样本NAC 后，缓解组与未缓解组Ktrans、Kep、Ve、Vp 比较

NAC 后，缓解组post-Ktrans、post-Kep、post-Ve、post-Vp 均明显低于未缓解组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。两组间化疗前后参数差值ΔKtrans、ΔVe、ΔVp差异无统计学意义（P＞0.05），但缓解组ΔKep明显低于未缓解组（P＜0.05）（表2）。

表2 肿瘤病理样本NAC 后，缓解组与未缓解组参数比较

2.4 DCE-MRI 定量参数诊断肿瘤坏死率的效能比较

分别以NAC 后定量参数和化疗前-后参数差值绘制ROC 曲线（图3）。结果表明，化疗后参数评估效能优于化疗前-后参数差值，post-Ktrans、post-Kep、post-Ve、post-Vp以及ΔKep可以有效区分肿瘤病理样本缓解和未缓解，其中post-Ktrans具有最高的诊断效能，最佳临界值为0.663/min，AUC 为0.745，其灵敏度为89.83%，特异性为52.24%。以上结果说明，反映即时骨肉瘤TNR 情况，同一时间点DCE-MRI 参数比化疗间期参数变化量更有参考价值。

图3 ROC 曲线

3 讨论

骨肉瘤化疗一线药物多为细胞毒性药物，NAC 后骨肉瘤细胞坏死增多，并新生大量骨化成分，肿瘤组织内微血管减少，细胞外间隙增大，微循环速度减慢，因此DCE-MRI 对比剂药代动力学情况随之改变[16-19]。DCE-MRI 具有实时、无创、可重复的优点，能够有效反映肿瘤血管的通透性和肿瘤组织的血液灌注并进行定量评估，在肿瘤疗效评价方面已有诸多报道[6-15]。当化疗有效时，肿瘤组织内微血管生成减少，成熟度增加，瘤细胞坏死增多，细胞外间隙增大，故Ktrans、Ve、Vp值降低，Kep值相应升高，本研究结果与既往研究一致[16-18]。

本课题组前期研究结果也显示，DCE-MRI 可以较好预测骨肉瘤NAC 的疗效，化疗后Ktrans值对化疗反应的预测能力最高，AUC 为0.943，敏感性、特异度分别达到了80.0% 和100%，证明DCE-MRI 对预测骨肉瘤NAC 疗效有一定价值[20]。Guo 等[21]针对69例接受NAC 的骨肉瘤患者的研究表明，Ktrans、Vp、kep值在有反应组和无反应组中差异具有统计学意义，化疗后有反应组Ktrans、Kep、Ve、Vp值均明显降低（TNR≥90%），说明DCE-MRI 参数可以反映病灶组织学改变。同时采用Kaplan-Meier 模型预测患者无事件生存期，发现化疗前低Ktrans和低Ve值患者的无事件生存期更长，其中Ve值具有统计学意义（P=0.02），此外化疗前Ve值与总生存天数也有明显相关性（P=0.03），为预测NAC 反应良好组无事件生存期和总生存天数提供依据。该团队曾报道采用DCE-MRI 评估贝伐单抗治疗骨肉瘤疗效的研究，发现用药后Ktrans及Vp随时间延长动态下降，低Ktrans和Vp值与更长的无事件生存期具有相关性（P=0.034）[22]。

虽然DCE-MRI 评估肿瘤疗效及判断预后效能较高，但DCE-MRI 大量的数据测量涉及ROI 的选取，上述大部分研究采用在肿瘤最大层面选取整个病灶作为感兴趣区，而骨肉瘤异质性明显，难以将坏死、囊变、钙化、出血及肉眼可见瘤血管等区域剔除，大范围ROI 所得到参数为平均值，并不能真实反映各区域肿瘤组织信息，均会影响测量结果的准确性[16-18，20-22]。因此，本研究依据骨肉瘤TNR 评估标准和方法，采用影像-病理位置匹配的方法，确定与瘤段切片最为接近的DCE-MRI 矢状位影像层面，将病灶划分成大小为1 cm×1 cm 的ROI，严格进行化疗前、化疗后影像ROI 与病理样本匹配，能够更细致反映每个组织块的坏死率与定量参数之间的关系[5]。结合ROC 曲线效能评价，发现与手术切除的肿瘤TNR 结果对照，NAC后DCE-MRI 参数较NAC 前后参数差值评价TNR效果更佳，其中化疗后Ktrans的评价效能最高。故应用DCE-MRI 评价即时肿瘤坏死情况有一定临床价值。

本研究结果表明，与获取肿瘤病理检测结果时间点最相近的全程NAC 后术前定量DCE-MRI 参数能够更准确地评估疗效。说明近乎同一时间点的影像—病理对照具有更好的可比性。有研究表明肿瘤NAC疗程间期DCE-MRI 参数改变与疗效评估和生存期预测具有相关性，但是NAC 间期无法通过有创手术取材检测TNR[20-22]。本研究结果或可打破这一局限，DCE-MRI 具有即时无创评估骨肉瘤肿瘤坏死情况的应用潜力，有助于及时调整化疗方案，制定个体化治疗决策。

本研究的局限性：1）纳入分析的病例数相对较少，病理组织样本分布不均，可能会对分析结果有一定程度的影响，因此还需要扩大病例数及病理组织样本量进行进一步研究；2）骨肉瘤异质性明显，NAC 后病理改变更复杂，骨肉瘤新辅助化疗后定量DCE-MRI 参数与肿瘤亚型、化疗方案、治疗时间等的关系有待更深入的研究。

综上所述，DCE-MRI 通过对Ktrans、Kep、Ve、Vp值的测量来监测骨肉瘤对NAC 的疗效，提供常规MRI 不能提供的信息，毋庸置疑是骨肉瘤非常有潜力的疗效监测手段，但是其实施、参数设置及数据分析尚未得到统一，需进一步研究。