李月婵，操俊，庄林，王佳丽，张同存，詹永成，罗学刚*

（1.天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室，天津 300457；2.天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津 300457；3.宁夏杞果兄弟生物科技有限公司，宁夏中卫 755000）

枸杞子是茄科枸杞属植物枸杞（Lycium barbarum L）的干燥果实。枸杞子作为常见的药食同源食材，在我国已有2 000多年的食用历史。《本草纲目》记载“枸杞能补肾润肺，生精益气，此乃平补之药，所谓精不足者补之以味也”。研究表明，枸杞含有丰富的枸杞多糖、甜菜碱、抗坏血酸及多种微量元素，具有抗衰老、抗肿瘤、降血脂、降血糖、降血尿酸等功效。但是，目前市面上现代化枸杞深加工产品的种类不够丰富。

益生菌又称有益菌，主要定植在人体的口腔、皮肤、阴道和肠道环境中。自第一株益生菌被成功分离以来，其赋予宿主的益生效果引起了科学界的广泛关注。而且，益生菌发酵在改善果蔬等食材风味、促进营养物质转化与吸收等方面，同样有着重要的作用。本课题组前期已对枸杞发酵饮料的工艺进行了优化研究，并建立了枸杞与胡萝卜、牛乳等的复合发酵饮料等制备工艺。但发酵饮料在运输、销售等过程中的冷链物流可导致总成本偏高，往往需要通过改善包装方式或改变饮品形式等手段降低其储运成本。相对于液体饮料来说，固体饮料由于其体积小、易于运输与携带等特点，发展相当迅速。

泡腾片是国内外日益流行的一种较为新颖的片剂类型，内含酸性和碱性泡腾剂，遇水崩解时即可发生泡腾反应，生成大量二氧化碳气体，形成澄清透明的溶液。由于泡腾片兼具固体饮料和液体饮料的优点，体积小，便于保存和运输，适合现代化生活的快节奏，因此深受消费者的青睐。然而，关于益生菌发酵枸杞泡腾片的研究，目前国内外少见报道。为此，本研究在前期工作基础上，对三联益生菌发酵后的枸杞原浆进行冷冻干燥处理，结合感官评价优化辅料组分，开发一种风味独特、口感优良的发酵枸杞泡腾片，为其他药食同源成分泡腾片的制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌株

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC8198、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）LTJ28、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）YR2-2：天津科技大学微生态与分子药理研究室-80℃保存。

1.1.2 试剂

枸杞原浆（食品级）：宁夏杞果兄弟生物科技有限公司；碳酸氢钠（分析纯）：中英保健食品有限公司；柠檬酸（分析纯）：潍坊英轩实业有限公司；乳糖（分析纯）：浙江一诺生物科技有限公司；甜菊糖苷（分析纯）：曲阜香州甜菊制品有限公司；聚乙二醇6000、木糖醇（均为分析纯）：天津泰进科技有限公司；浓缩乳清蛋白（分析纯）：天津市江天化工有限公司；壳寡糖（分析纯）：广州优蓝海洋生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

4R2204 CN型电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；TG16B型高速台式离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；LRH-150型生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司、DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器：上海东玺制冷仪器设备有限公司；PSSJ-4V型精密pH计：上海精密科学仪器公司；HCB-900V型垂直层流洁净工作台：海尔集团控股有限公司；Alpha 2-4 LD plus快速冷冻干燥机：德国Christ公司；DGG-9070BD型电热鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；ZP-9型旋转式压片机：广州大祥电子机械设备有限公司；SY-3D型片剂四用测定仪：上海黄海药检仪器有限公司。

1.3 发酵枸杞泡腾片的工艺优化

1.3.1 工艺流程

制备工艺流程见图1。

图1 制备工艺流程图Fig.1 Preparation process flow diagram

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 发酵枸杞冻干粉的制备

按照前期研究的最优发酵工艺和冻干工艺对枸杞原浆进行预处理。发酵工艺条件为枸杞原浆和饮用水的液料比为7.9∶1（mL/mL）、接种量为4%（植物乳杆菌CGMCC8198的接种量为1%、乳酸片球菌LTJ28的接种量为1%、干酪乳杆菌YR2-2的接种量为2%）、发酵时间为7.49 h、发酵温度为37℃。冻干保护剂由浓缩乳清蛋白粉、壳寡糖和木糖醇组成，其质量分数为15%、6%及1.5%。将发酵后的枸杞原浆加入4%的保护剂，经-20℃预冻24 h，再经真空冷冻干燥机干燥12 h，过80目筛，即可得到发酵枸杞冻干粉。

1.3.2.2 制粒

参照杨梅等的研究并稍做调整，选择柠檬酸做酸性泡腾剂、碳酸氢钠做碱性泡腾剂、乳糖做填充剂，甜菊糖苷做矫味剂，饮用水做黏合剂、聚乙二醇6000做润滑剂。将冻干粉、矫味剂和填充剂分别与酸性泡腾剂和碱性泡腾剂混合制备软材，软材需满足“手握成团，轻压即散”的标准。将酸性与碱性软材分别过14目筛制备酸粒和碱粒，并于37℃电热鼓风干燥箱烘干30 min。

1.3.2.3 压片

将烘干后的酸粒和碱粒混合均匀，加入适量润滑剂放置于旋转压片机压片成型。

1.3.3 发酵枸杞泡腾片的感官评定标准

分别取5 g泡腾片样品，加入25℃饮用水100 mL，待完全溶解后，由食品专业相关人员组成感官评定小组，分别从香气、口感、状态3个方面对泡腾片进行评分，总分100分。泡腾片感官评价标准见表1。

表1 泡腾片感官评价标准Table 1 Effervescent tablet sensory evaluation criteria

1.3.4 发酵枸杞泡腾片制备的单因素试验

以填充剂含量7%、矫味剂含量3%、泡腾剂含量70%、泡腾剂酸碱质量比1.2∶1为基础条件，以矫味剂含量（1%、2%、3%、4%、5%）、泡腾剂含量（60%、65%、70%、75%、80%）、泡腾剂酸碱质量比（0.8∶1、1.0∶1、1.2 ∶1、1.4 ∶1、1.6 ∶1）为变量进行单因素试验，考察各个因素对泡腾片感官品质的影响。

1.3.5 发酵枸杞泡腾片制备的响应面设计

选取单因素试验确定的各因素的较优值，以感官评分为响应值，采用Design-Expert.10响应面设计软件，根据Box-Behnken Design中心试验设计原理设计三因素三水平的试验，具体因素水平见表2。

表2 Box-Behnken Design因素水平Table 2 Box-Behnken Design level of form factors

1.4 发酵枸杞泡腾片的质量检测

根据《中华人民共和国药典》2020年版中的检测方法，对发酵枸杞泡腾片的外观、崩解时间、pH值、重量差异、硬度和脆碎度6项指标进行检测。

1.4.1 外观的测定

取若干泡腾片放置于手心内，在自然光下以肉眼观察片剂的外观。

1.4.2 重量差异的测定

随机选取6片泡腾片，称量每片重量，再称量总重量并计算平均值。

1.4.3 崩解时间的测定

对泡腾片崩解时间进行检测，随机抽取6片。

1.4.4 pH值的测定

用pH计测定泡腾片溶解后溶液的pH值，随机抽取6片。

1.4.5 硬度的测定

利用片剂四用测定仪测定泡腾片硬度，随机测定3片。

1.4.6 脆碎度的测定

利用片剂四用测定仪测定泡腾片脆碎度，随机测定22片。

1.5 数据分析

采用GraphPad Prism 7软件、Design-Expert.10响应面分析软件进行数据的处理和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 矫味剂含量对发酵枸杞泡腾片的影响

甜菊糖苷是一种以甜菊干叶为原料的食品添加剂，具有甜度高、能量低等特点，因此广泛应用于饮料、糕点等食品加工行业。不同含量的矫味剂对泡腾片感官评分的影响见图2。

图2 不同含量的矫味剂对泡腾片感官评分的影响Fig.2 Effects of different contents of flavoring agents on sensory scores of effervescent tablets

由图2可知，随着矫味剂含量的增加，感官评分先升高再降低，这说明一定量的矫味剂可增加饮料的甜味，过多则会造成风味的不协调。当矫味剂含量为3%时，该泡腾片饮料酸甜适中，口感最佳。因此，适宜的矫味剂含量为3%。

2.1.2 泡腾剂含量对发酵枸杞泡腾片的影响

泡腾剂用量决定了泡腾片的泡腾效果、口感、溶解性等性质。当泡腾剂含量过低时，往往达不到崩解时间的要求，且碳酸含量不足可造成整体风味寡淡；泡腾剂过高又会有酸涩感，若pH值偏低也会影响口感。不同含量的泡腾剂对泡腾片感官评分的影响见图3。

图3 不同含量的泡腾剂对泡腾片感官评分的影响Fig.3 Effects of different contents of disintegrating agents on sensory scores of effervescent tablets

由图3可知，随着泡腾剂含量的增加，枸杞泡腾片的感官评分先升高后降低，在泡腾剂含量为70%时，泡腾片的感官评分最高，因此，适宜泡腾剂含量为70%。

2.1.3 泡腾剂酸碱质量比对发酵枸杞泡腾片的影响

泡腾剂包括一个酸性崩解剂和一个碱性崩解剂。由于柠檬酸成本较低，且酸味爽快可口，碳酸氢钠溶解性较好，因此是目前应用最广泛的泡腾剂酸源和碱源。泡腾剂不同的酸碱质量比对感官评分的影响见图4。

图4 不同的泡腾剂酸碱质量比对感官评分的影响Fig.4 Effects of acid-base mass ratio of different contents of disintegrating agents on the sensory scores

由图4可知，当柠檬酸与碳酸氢钠质量比为1.2∶1时感官评分高达53，随着柠檬酸的增加感官评分急速下降，这可能是由于泡腾片水溶液过酸所致风味变差。因此，泡腾剂酸碱质量比为1.2∶1较为适宜。

2.2 发酵枸杞泡腾片的响应面优化分析

2.2.1 响应面优化设计

选取矫味剂含量、泡腾剂含量和泡腾剂酸碱质量比为自变量，以感官评分为因变量，设计响应面优化试验，响应面试验设计方案及结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface test design and results

2.2.2 发酵枸杞泡腾片的感官评价模型的建立与分析

通过Design-Expert.10对表3的数据进行处理，得到发酵枸杞泡腾片感官评分与3个因素的多元二次回归方程为Y=-1 843.55+79.575A+37.195B+838.25C+0.35AB-2.5AC-5BC-16.825A-0.233B-201.875C。模型回归系数显著性检验结果如表4所示。

表4 模型回归系数显著性检验结果Table 4 Model regression coefficient significance test results

由表4可知，模型P＜0.000 1，差异高度显著，失拟项P＞0.05，差异不显著，相关系数R=0.994 8，表明该模型拟合程度较好，可以对该泡腾片工艺进行预测。CV=2.34%，说明模型较可靠，SNR=28.871＞4，R=0.988 1，说明模型置信度较高。3个因素对感官评分影响的顺序为B>C>A。交互作用AB对感官评分影响显著，交互作用BC对感官评分影响高度显著；一次项B对感官评分的影响极显著；二次项A、B、C对感官评分的影响高度显著。

2.2.3 交互作用分析

通过Design-Expert.10软件对得出的试验数据进行分析，建立了该工艺条件的模型。在保证矫味剂含量、泡腾剂含量与泡腾剂酸碱质量比这3个因素中一个因素不变的情况下，得到其他因素的三维响应面曲线和等高线。不同因素之间的交互作用的响应面曲线与等高线具体见图5～图7。

图5 矫味剂含量和泡腾剂含量对感官评分影响的响应面与等高线图Fig.5 Response surface and contour map of the influence of flavoring and effervescent on sensory score

图6 矫味剂含量和泡腾剂酸碱质量比对感官评分影响的响应面与等高线图Fig.6 Response surface and contour map of the influence of flavoring and effervescent acid-base mass ratio on sensory score

图7 泡腾剂含量及其酸碱质量比对感官评分影响的响应面与等高线图Fig.7 Response surface and contour map of the influence of effervescent and effervescent acid-base mass ratio on sensory score

响应曲面越陡以及等高线越密集，表明因素之间的交互作用越明显。从图5～图7可以看出，交互作用为BC>AB>AC。说明泡腾剂含量和其酸碱质量比的交互作用对泡腾片的感官评分影响最为显著，而矫味剂含量与泡腾剂酸碱质量比的交互作用对泡腾片的感官品质影响相对较弱。

2.2.4 验证试验

通过响应面分析得到最优工艺条件为矫味剂含量为2.9%、泡腾剂含量为69.1%、泡腾剂酸碱质量比为1.2∶1，在此条件下得到的感官评分预测值为66。在此条件下进行3次验证试验，得到的感官评分平均值为66.5，与模型预测值接近，证明该模型可靠。由此工艺得到的发酵枸杞泡腾片溶解后酸甜可口，兼具枸杞的清香和乳酸风味，为中试试验生产应用提供了参考。

2.3 发酵枸杞泡腾片的质量检测

2.3.1 外观的测定结果

泡腾片表面呈橙色且色泽均匀，外观完整光洁，无断裂、变形现象。

2.3.2 重量差异的测定结果

为了保证食品含量的准确性，重量差异必须控制在制定范围内，才能确保泡腾片的品质稳定性。随机检测发酵枸杞泡腾片，片重均为0.33 g，表明该泡腾片在重量差异这项指标上符合《中华人民共和国药典》2020年版内的规定。

2.3.3 崩解时间的测定结果

泡腾片的崩解时间等指标检查结果见表5。

表5 泡腾片的崩解时间、pH值及硬度检查结果Table 5 Disintegration time，pH value and hardness test results of effervescent tablets

泡腾片的崩解时间是泡腾片品质的一个重要指标，崩解时间过长会影响泡腾片的食用性。如表5所示，枸杞泡腾片的平均崩解时间为180.83 s，符合《中华人民共和国药典》2020年版对于泡腾片需要在5 min内崩解的标准，且泡腾后水溶液澄清，无明显颗粒残留。

2.3.4 pH值的测定结果

取1片泡腾片投入100 mL饮用水中，待完全溶解后用pH计测定溶液的pH值。如表5所示，随机测定6片枸杞泡腾片，pH值均在6以下，平均pH值为5.71，相对标准偏差为3.32%。表明该泡腾片溶解后是一种弱酸性饮料，不刺激消化道，适合老人和幼儿等肠胃弱的群体。

2.3.5 硬度的测定结果

片剂的硬度指片剂抵抗进入其表面的硬物质的能力，只有具有一定的硬度，才可以确保其在储运过程中完整无破损。如表5所示，枸杞泡腾片的平均硬度为14.5 N，符合《中华人民共和国药典》2020年版的规定。

2.3.6 脆碎度的测定结果

泡腾片的脆碎度检查结果见表6。

表6 泡腾片的脆碎度检查结果Table 6 Friability test results for effervescent tablets

如表6可知，枸杞泡腾片减失质量比例小于1%，且用于检测的泡腾片均无断裂及粉碎情况，符合《中华人民共和国药典》2020年版对片剂脆碎度的要求。

3 结论

本研究首先通过单因素试验，基于发酵枸杞泡腾片的矫味剂含量、泡腾剂含量和泡腾剂酸碱质量比这3个因素对其感官品质进行研究，并利用响应面法进行Box-Behnken设计，建立发酵枸杞泡腾片的二次多项式回归方程。运用该模型进行最优工艺条件预测，得到的最优工艺条件为矫味剂含量为2.9%、泡腾剂含量为69.1%、泡腾剂酸碱质量比为1.2∶1。在此条件下的感官评分预测值为66。对该模型进行验证试验，感官评分实际值为66.5，与预测值接近，因此该模型具有较强的科学性。按照《中华人民共和国药典》2020年版的方法，进一步测定发酵枸杞泡腾片的外观、崩解时间、pH值、重量差异、硬度和脆碎度，结果表明所制泡腾片均符合《中华人民共和国药典》2020年版相关规定。按照本工艺生产的发酵枸杞泡腾片既有枸杞滋阴补肾和益生菌对于健康的系统性调理等功效，又具备泡腾片易溶易携、能保持快速恢复液体产品品质的优点。此外，本品以甜菊糖苷做矫味剂，进一步满足了消费者对于无糖健康食品的需求，具有广阔的市场前景。