姚燕箐 汪焱 徐文静 吴晨曦 楚秉泉 夏道宗

浙江中医药大学药学院 杭州 310053

急性痛风性关节炎归属中医的 “痹病”“历节风”范畴，最早的相关记载可追溯至《黄帝内经》中的“痹症”，《名医别录》中陶弘景首次将其命名为“痛风”[1]，该名称沿用至今。急性痛风性关节炎的发生主要与体内嘌呤代谢水平变化，造成尿酸排出减少或生成增多有关，过多的尿酸盐晶体沉积在关节内，会引起关节部位病变，产生炎症反应[2]。近年来随着社会的不断发展进步，人们的生活习惯和饮食方式也发生着变化，急性痛风性关节炎的患病率大大增高。

研究表明，急性痛风性关节炎的发病机制与机体代谢、炎症反应和免疫应答密切相关[3]。NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）炎症小体和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路在炎症进程中被激活，使得下游的白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）等炎症因子释放，放大炎症级联反应[4]。

目前临床上应用于急性痛风性关节炎的药物主要包括非甾体类抗炎药、秋水仙碱等，不良反应较多，对胃肠道及肝肾功能均有影响，存在一定的用药局限性[5]。因此，开发一种安全有效的药物，对于急性痛风性关节炎的治疗具有重要意义。现代基础研究证实，中药治疗急性痛风性关节炎具有一定的疗效[6-8]。异落新妇苷（isoastilbin，IA）是一种主要存在于土茯苓、黄芪等中药中的二氢黄酮醇苷类化合物，本课题组研究发现其具有良好的抗氧化活性，且在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的小鼠单核巨噬细胞白血病炎症模型中展现出了抗炎能力[9]。本研究基于NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路，探讨IA对小鼠急性痛风性关节炎的作用及机制，为急性痛风性关节炎的新药开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 雄性无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级C57BL/6小鼠75只，7～8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005]，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2018-0012]。

1.1.2 主要试剂 尿酸钠（monosodium urate，MSU）购于美国Sigma-Aldrich公司（批号：BC8R7559）；秋水仙碱购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司（批号：G1514018）；二喹 啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司（批号：50206）；鼠IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒均购于美国eBioscience公司（批号：151906029、153149017、161044013）；β-actin、NF-κB抑制蛋白激酶α（inhibitor of nuclear factor-κB kinase α，IKKα）、Phospho-IKKα、NF-κB抑制蛋白α（inhibitor of nuclear factor-κB α，IκBα）、Phospho-IκBα、Phospho-NF-κB p65、NF-κB p65、NLRP3、Histone H3抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司（批号：15、5、19、10、18、16、9、3、9）；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1）、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis associated speck like protein containing a CARD，ASC）抗体均购于美国Abcam公司（批号：GR202191-1、2813878）。

1.1.3 主要仪器 BSA224S-CW型电子天平购于赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；MagNA Lyser匀浆器购于德国Roche公司；Mini-PROTEAN Tetra System垂直电泳系统购于美国Bio-Rad公司；Power Blotter XL半干转膜仪购于美国Thermo Fisher Scientific公司；Odyssey Clx双色红外激光成像系统购于美国LI-COR公司；C13210-01数字病理切片扫描系统为日本滨松公司产品；Synergy H1型多功能微孔板检测仪购于美国BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 药物的制备和配制 土茯苓购于浙江中医药大学中药饮片有限公司，鉴定后按本课题组前期研究方法自制IA，提取的IA符合指纹图谱质控要求[9]。MSU粉末过200目筛后，精密称取250 mg，加入纯水5 mL，配成50 mg·mL-1的MSU混悬液，4℃保存，临用前超声混匀。精密称取IA样品250 mg，加入0.5%的羧甲基纤维素钠 （sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）溶液5 mL，配成50 mg·mL-1的单体溶液，4℃保存。 根据小鼠体质量，以0.9%氯化钠溶液稀释到所需浓度。精密称取秋水仙碱250 mg，加入纯水5 mL，配成50 mg·mL-1的秋水仙碱溶液，4℃保存，临用时稀释到所需浓度。

1.2.2 实验分组及给药 小鼠适应性饲养1周后，随机分为5组，每组15只，分别为正常组、模型组、秋水仙碱组、IA低剂量组、IA高剂量组，正常组和模型组给予0.9%氯化钠溶液，秋水仙碱组给予秋水仙碱溶液（1 mg·kg-1），IA低、 高剂量组分别给予相应剂量（25、50 mg·kg-1）的IA溶液，连续灌胃7 d。

1.2.3 建立小鼠急性痛风性关节炎模型 第6天灌胃后1 h，用无菌微针吸取0.025 mL的MSU混悬液，注射至除正常组外其他4组小鼠的踝关节中，注射后可以观察到小鼠踝关节对侧明显鼓起，正常组注射等体积的0.9%氯化钠溶液。

1.2.4 测量小鼠踝关节肿胀度 造模前在小鼠踝关节上方0.5 cm处用不褪色的记号笔标记一条横线，后续测量时以横线为准，造模前及造模后2、4、6、10、24 h分别用课题组自制足趾容积测量装置[10]测量小鼠足趾容积，并按下列公式计算小鼠踝关节肿胀率。踝关节肿胀率（%）=（造模后足趾容积-造模前足趾容积）/造模前足趾容积×100%

1.2.5 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察IA对小鼠急性痛风性关节炎踝关节炎性浸润的影响 取材时从小鼠踝关节上方划线处剪下关节，固定于甲醛中，固定完成后脱钙，送样进行切片、HE染色，采用数字病理切片扫描系统进行拍片。

1.2.6 ELISA检测小鼠踝关节组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平 称取关节质量，按照1∶10（g·mL-1）的比例加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），以匀浆器研碎，完全研碎后4℃下3 000 r/min离心10 min，收集上清液，根据ELISA试剂盒说明书检测炎症因子水平。

1.2.7 免疫印迹法检测相关蛋白表达 将关节剪碎放入研钵中，加适量液氮研磨，研磨完全后称取质量，按照1:10（g·mL-1）的比例加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液，冰上裂解1 h后4℃下12 000 r/min离心15 min，收集上清液，用BCA试剂盒进行蛋白定量。电泳完成后，转至二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，封闭1 h后加入一抗4℃孵育过夜，次日加入二抗孵育1 h，用Odyssey Clx双色红外激光成像系统显影。

1.3 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠踝关节肿胀率比较 造模后2 h，除正常组外，其余各组小鼠踝关节均明显肿胀，表明急性痛风性关节炎模型造模成功，各组踝关节肿胀率均在造模后4 h时达到最大值，4 h后肿胀率逐渐降低。与正常组比较，模型组小鼠踝关节肿胀率在造模2～24 h内显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，秋水仙碱组造模2～24 h内踝关节肿胀率均显著降低 （P＜0.01），IA低、高剂量组造模2～24 h内踝关节肿胀率均显著降低（P＜0.01）。与秋水仙碱组比较，IA低剂量组造模2～24 h内踝关节肿胀率均显著升高（P＜0.01），IA高剂量组造模4～10 h内踝关节肿胀率均显著降低 （P＜0.05，P＜0.01），而2、24 h时踝关节肿胀率差异无统计学意义（P＞0.05）。与IA低剂量组比较，IA高剂量组造模2～24 h内踝关节肿胀率均显著降低（P＜0.01）。见表1。表明IA能缓解MSU引起的小鼠踝关节肿胀，且高剂量组减轻踝关节肿胀率的效果与秋水仙碱组类似。

表1 各组小鼠踝关节肿胀率比较Tab.1 Comparison of ankle joint swelling rate in each group(±s,n=15)

表1 各组小鼠踝关节肿胀率比较Tab.1 Comparison of ankle joint swelling rate in each group(±s,n=15)

注：与正常组比较， **P＜0.01；与模型组比较， ##P＜0.01；与秋水仙碱组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与IA低剂量组比较，▲▲P＜0.01。Note:Compared with normal group,**P＜0.01;compared with model group,##P＜0.01;compared with colchicine group, △P＜0.05, △△P＜0.01;compared with IA low dose group, ▲▲P＜0.01.

组别 2 h 4 h 6 h 10 h 24 h正常组 38.83±2.99 49.86±3.50 38.62±3.36 27.27±4.02 15.16±3.62模型组 70.02±3.14** 91.31±4.98** 69.42±6.63** 58.32±6.62** 44.78±5.85**秋水仙碱组 49.85±4.16## 69.25±5.04## 48.40±6.22## 36.85±4.95## 21.68±4.30##IA 低剂量组 59.93±5.37##△△ 81.61±9.47##△△ 57.30±6.26##△△ 47.74±7.75##△△ 34.98±6.39##△△IA 高剂量组 52.18±5.48##▲▲ 58.36±2.53##△△▲▲ 42.21±6.56##△▲▲ 30.62±5.47##△▲▲ 18.24±4.87##▲▲

2.2 各组小鼠踝关节炎性浸润比较 正常组小鼠踝关节几乎未见炎症发生；模型组踝关节组织内有大量炎性细胞浸润，表明小鼠踝关节内发生了较强的炎症反应，秋水仙碱组炎性浸润情况较轻，IA各剂量组随给药剂量增加，炎性浸润情况减轻，但减轻程度不如秋水仙碱组，表明IA可以减轻MSU诱导的小鼠踝关节炎性浸润现象，但与秋水仙碱组比较效果较差。见图1。

图1 各组小鼠踝关节病理形态学观察（HE染色，100×）Fig.1 Pathomorphology observation of ankle joint in each group（HE staining， 100×）

2.3 各组小鼠踝关节组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 与正常组比较，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，秋水仙碱组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显降低（P＜0.01）；IA低、高剂量组IL-6、TNF-α水平均明显降低（P＜0.01），IA低剂量组IL-1β的水平降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），IA高剂量组IL-1β水平明显降低（P＜0.01）。与秋水仙碱组比较，IA低剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高 （P＜0.01）；IA高剂量组TNF-α水平升高（P＜0.01）， 但IL-1β、IL-6的水平与秋水仙碱组类似，差异无统计学意义（P＞0.05）。与IA低剂量组比较，IA高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。见图2。表明IA能够剂量依赖性地降低MSU诱导的急性痛风性关节炎小鼠踝关节分泌的炎症因子水平，具有一定的抗炎作用。

图2 各组小鼠踝关节中IL-1β、IL-6和TNF-α水平比较Fig.2 Comparison of level of IL-1β， IL-6 and TNF-α of ankle joint in each group

2.4 各组小鼠踝关节组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达比较 与正常组比较，模型组小鼠踝关节组织中的NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达显著增高（P＜0.01）。与模型组比较，秋水仙碱组和IA低、高剂量组蛋白表达量显著降低（P＜0.01），且IA高剂量组比低剂量组降低更多（P＜0.01）。与秋水仙碱组比较，IA低剂量组NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达量均升高（P＜0.05，P＜0.01），IA高剂量组NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达量均减低（P＜0.01）。 见图3。

图3 各组小鼠踝关节中NLRP3炎症小体相关蛋白表达比较Fig.3 Comparison of expression of NLRP3 inflammasome protein of ankle joint in each group

2.5 各组小鼠踝关节组织中NF-κB信号通路相关蛋白表达比较 与正常组比较，模型组小鼠踝关节组织中的p-NF-κB/NF-κB、p-IκBα/IκBα、p-IKKα/IKKα蛋白表达比例均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，秋水仙碱组和IA低、高剂量组蛋白表达比例显著降低（P＜0.01），且IA高剂量组比低剂量组降低更多（P＜0.01）。 与秋水仙碱组比较，IA低剂量组p-IκBα/IκBα、p-IκBα/Iκκα蛋白表达比例均升高（P＜0.01）、p-NF-κB/NF-κB蛋白表达比例降低 （P＜0.01），IA高剂量组p-NF-κB/NF-κB、p-IκBα/IκBα、p-IKKα/IKKα蛋白表达比例均降低（P＜0.01）。 见图4。

图4 各组小鼠踝关节中NF-κB信号通路相关蛋白表达比较Fig.4 Comparison of expression of NF-κB signaling pathway related protein of ankle joint in each group

2.6 各组小鼠踝关节组织中NF-κB p65蛋白入核比较 与正常组比较，模型组细胞核内p-NF-κB蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，秋水仙碱组和IA低、高剂量组细胞核内p-NF-κB蛋白表达均显著降低（P＜0.01），且IA高剂量组比低剂量组降低更多（P＜0.01）。与秋水仙碱组比较，IA低剂量组细胞核内p-NF-κB蛋白表达升高（P＜0.01），IA高剂量组细胞核内p-NF-κB蛋白表达降低（P＜0.01）。 各组胞质内p-NF-κB/NF-κB蛋白表达之比差异无统计学意义（P＞0.05）。 见图5。

图5 各组小鼠踝关节组织中NF-κB p65蛋白入核比较Fig.5 Comparison of NF-κB p65 protein of ankle joint entered into nucleus in each group

3 讨论

急性痛风性关节炎的发生主要与嘌呤代谢紊乱、尿酸盐沉积于关节有关，在临床上多辨证为湿热蕴结型，患者在饮食方面不节制，嗜食膏脂厚味，致使湿热滞于经络，气血不畅，导致关节红肿热痛[11]。中医认为，有关痛风，脾肾亏虚是其病机关键；湿、痰、淤是其基本病机；饮食、情志、寒湿是相关致病因素，治疗应以化湿逐瘀祛痰为主，用药可选土茯苓等[12]。土茯苓是一味常用的中药材，为百合科植物光叶菝葜（Smilax glabra Roxb.）的干燥根茎，其味甘、淡，性平，归肝、胃经，具有解毒祛湿、通利关节的作用[13]。IA作为落新妇苷的同分异构体，在土茯苓中广泛存在[14]，但IA干预急性痛风性关节炎的相关报道较少，作用机制尚未完全明确。

MSU作为损伤相关的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）被人体固有免疫细胞细胞膜上的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）识别后，人体启动免疫应答，经细胞内一系列信号转导， 激活NLRP3、IL-1β、IL-18、TNF-α等炎症因子表达，从而诱导炎症反应[15]。NOD样受体是PRR家族中能感知细胞内病原性信号的一族胞质型PRR，NLRP3是其中的重要成员，NLRP3与ASC及caspase-1组成分子量约700 kDa的NLRP3炎症小体，激活IL-1β转化酶，将效应蛋白caspase-1催化为有活性的p20和p10两个亚单位，参与IL-1β和IL-18的加工、分泌，诱导细胞发生炎症坏死[16]。本研究参考Reber等[17]的急性痛风性关节炎造模方法，利用微针在踝关节一侧注射MSU混悬液，并在对侧踝关节处注射等体积PBS作为对照，成功建立了小鼠急性痛风性关节炎模型。本研究发现，IA能够明显下调由MSU诱导的NLRP3、caspase-1、ASC蛋白的表达，并降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的水平，说明IA可以通过下调NLRP3炎症小体相关蛋白，抑制下游IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌，减轻急性痛风性关节炎的相关症状。

急性痛风性关节炎发生时，NF-κB信号通路被激活。NF-κB由Rel蛋白二聚体组成，在Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）与DAMPs或病原相关的分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）结合后，与髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）的羧基末端相互作用，使MyD88活化，随后募集κB激酶的抑制剂IKK，IKK被激活后，抑制蛋白IκB被磷酸化及泛素化，NF-κB随即从p50/p65/IκB异源三聚体中解离出来，转位至细胞核内，与核内脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）上的特异序列结合，增强炎症相关基因的转录，在调节炎症因子释放过程中起到关键的作用[18]。本研究结果表明，在C57BL/6小鼠中，MSU诱导可以激活NF-κB信号通路，从而促进pro-IL-1β的释放。低、高剂量的IA和秋水仙碱均能够显著抑制NF-κB信号通路的激活，减少pro-IL-1β的释放。NF-κB信号通路与NLRP3炎症小体同时被抑制，下游炎症因子的分泌减少，从而能够减轻急性痛风性关节炎的症状。与常用抗痛风药物秋水仙碱比较，IA在减轻小鼠关节肿胀度和炎性浸润、降低炎症因子分泌水平、降低NLRP3炎症小体及NF-κB信号通路相关蛋白表达方面的效果类似，同时不良反应可能更小。

综上所述，本研究证明IA通过同时抑制NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路，抑制下游相关炎症因子的释放，从而能够减轻急性痛风性关节炎的症状，为临床上治疗急性痛风性关节炎提供了新的思路。