林俊言 何金霞 郑千姿 邱梦婷 房军帆 方剑乔 杜俊英

浙江中医药大学第三临床医学院浙江省针灸神经病学研究重点实验室 杭州 310053

根据国际疼痛研究学会（International Association for the Study Pain，IASP）对疼痛的定义，疼痛包含了痛感觉和痛情绪双重含义。现有研究报道，慢性痛常伴发负性情绪，其中50%的慢性痛患者伴有焦虑症[1]，这对患者的身心造成了极大的影响。目前临床对于焦虑情绪的治疗，仍局限于药物治疗，用于镇痛以及缓解负性情绪的优化治疗方案仍需进一步探索。

当前大量研究针对疼痛刺激与大脑皮层的反应，但是对于边缘系统与疼痛之间的关系研究仍相对较少。海马作为边缘系统的重要组成部分，位于丘脑和内侧颞叶之间，与疼痛的情绪-动机有特殊的关联[2-3]。有研究表明，海马参与疼痛信号的处理过程[4-5]，海马角1（Cornu Ammonis 1，CA1）、 海马角3（Cornu Ammonis 3，CA3）以及齿状回（Dentate Gyrus，DG）三区与慢性疼痛及疼痛产生的情感障碍密切相关[6-9]。γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）是脑内主要的抑制性神经递质，大脑神经递质分泌失调或神经发育异常，可导致GABA与兴奋性神经递质谷氨酸（glutamic acid，Glu）突触之间传递失衡，该失衡与痛情绪的发生和发展密切相关[10-11]，恢复GABA能系统对痛情绪的调控有着重要作用。谷氨酸 脱 羧 酶 （glutamic acid decarboxylase，GAD）是GABA的关键合成酶，有两种不同的异构体，即GAD65和GAD67，可作为监测GABA能神经传递的标记物[12]。GABA能神经元是多样化的神经元群体，依据表达分子标记物的不同，GABA能神经元主要可分为5个类型，其中表达小清蛋白（parvalbumin，PV）、生长抑制素 （somatostatin，SOM）、 神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）的神经元群最常见[13]。海马内GABA能神经元尽管只占神经元总数的10%～15%，但其群体多样性仍是皮层回路功能和调节方面的主要决定因素[14]。目前，关于慢性痛及痛情绪与海马中各区GABA能神经元之间的系统研究尚少见于报道。

电针的镇痛疗效已被广泛认可，被应用于治疗多种急性和慢性疼痛疾病，对疼痛相关的痛情绪也具有良好的干预作用[15-16]。前期研究中已证实电针干预慢性痛及其相关痛情绪的前扣带皮层（anterior cingulate cortex，ACC）GABA的相关机制[17-18]，而作为边缘系统重要组成部分的海马，电针干预海马GABA能系统的机制尚不清楚。

本研究通过建立完全弗氏佐剂（complete Freund's adjuvant，CFA）诱导的大鼠慢性炎性痛模型，造模后进行电针干预，观察其对大鼠机械痛阈（paw withdrawal threshold，PWTs）、焦虑行为，以及海马CA1、CA3、DG区中NPY、PV、SOM、GAD65/67及原癌基因蛋白（cellular protooncogene Fos，c-Fos）表达的影响，以期部分阐明电针干预痛情绪的海马GABA能系统机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 32只雄性清洁级健康SD大鼠，体质量（220±10）g，购于中国科学院上海实验动物中心[实验动物生产许可证号：SCXK （沪）2018-0006]，饲养于浙江中医药大学动物实验中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2018-0012]。 饲养温度22～26 ℃，湿度60%，给予标准饲料，自由饮水，保持饲养环境安静，通风良好，12 h∶12 h昼夜循环光照。本实验所有操作均符合中华人民共和国《实验动物管理条例》。

1.1.2 试剂与器材 CFA购于美国Sigma公司（批号：F5881）；兔抗PV多克隆抗体、兔抗NPY多克隆抗体、兔抗GAD65+67单克隆抗体、小鼠抗c-Fos单克隆抗体、驴抗小鼠IgG抗体、驴抗兔IgG抗体均购于美国Abcam 公 司 （ 批 号 ：ab11427、ab10980、ab183999、ab208942、ab150109、ab150061）； 兔抗SOM多克隆抗体购于Gene Tex公司（批号：GTX133119）；含4，6-二脒基-2-苯基吲哚 （4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）的抗荧光淬灭封片液购于上海碧云天生物技术有限公司（批号：P0131）。

von-Frey纤维丝购于美国Stoelting公司；HANS-200A韩氏穴位神经刺激仪购于南京济生医疗科技有限公司；高架O迷宫（elevated zero maze，EZM）为深圳瑞沃德公司产品；Smart 3.0分析软件购于美国Panlab公司；不锈钢一次性针灸针购于苏州医疗用品厂有限公司；蔡司光学显微镜为德国ZEISS公司产品。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将大鼠完全随机分为空白对照组、模型对照组、电针治疗组、假电针治疗组，每组8只。除空白对照组外，所有大鼠右侧足底中心皮下注射CFA 0.1 mL，以造模后1 d，PWTs显著下降为造模成功的标准；空白对照组注射等量的0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 干预措施 电针治疗组与假电针治疗组于造模后26 d开始干预。电针治疗组：采用0.25 mm×13 mm针灸针刺入大鼠双侧“后三里”穴（膝关节后外侧，在腓骨头下约5 mm处）和“昆仑”穴（后肢外踝与跟腱之间的凹陷中），连接HANS-200A韩氏穴位神经刺激仪，选用疏密波、频率2/100 Hz、强度0.5～1.5 mA（每10 min增加0.5 mA），治疗30 min，每日1次，连续4 d；假电针治疗组仅将针灸针刺入相同穴位皮下不通电，其操作同电针治疗组。其余两组不作干预。

1.2.3 PWTs检测 分别在造模前、造模后1、3、7、14、21、28 d，将大鼠放置于有透明有机玻璃的金属网箱中，大小20 cm×20 cm×15 cm，适应环境30 min。 在安静的状态下，参考Chaplan等[19]建立的方法，以von-Frey纤维丝测定大鼠右后足的PWTs。 用0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0、26.0 g纤维丝套组， 从4.0 g开始，避开足垫，刺激大鼠的右后足中心，使纤维丝“S”型弯曲并保持6～8 s，若大鼠抬腿或舔脚则被视为阳性，用“X”表示，更换为相邻的低克数纤维丝。若无反应，用“O”表示，更换为相邻的高克数纤维丝。从第1次出现“XO”或“OX”开始再检测4次，获得一连串的“OX”组合。 PWTs（g）=（10[Xf+κδ]）/10000计算。 如果连续5次刺激是“X”则为4.0 g，若连续5次刺激是“O”则为26.0 g。

1.2.4 EZM实验 在造模后29 d进行EZM实验，观察大鼠的焦虑行为。操作间保持较暗的光线，温度恒定在23℃左右，在安静的环境中进行，测试前将大鼠置于实验环境中2 h以适应环境。实验开始时，将大鼠头朝开放臂的方向放入开放臂和闭合臂交界处，记录5 min探索情况。用Smart 3.0软件进行数据分析，计算大鼠5 min中的总运动距离、开放臂运动距离、开放臂进入次数和开放臂停留时间。每次实验后用70%乙醇溶液擦拭实验场地，以避免前次大鼠残留气味的影响。

1.2.5 取样与样本处理 行为学实验完成后，大鼠以2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，用注射针头从心尖灌注4℃预冷的氯化钠溶液，至肝脏完全变色，再灌注4%多聚甲醛。冰上快速取出全脑，置于4%多聚甲醛溶液中固定6 h，继而移入15%、30%蔗糖溶液梯度脱水，液氮速冻后-80℃保存。取出大鼠全脑并包埋，-20℃下按照《大鼠脑立体定位图谱（第6版）》[20]，取含有海马的组织行25 μm切片，-80 ℃保存待用。

1.2.6 免疫荧光检测相关蛋白表达 从-80℃冰箱中取出切片，37℃复温1 h，以pH 7.40～7.44的含有吐温的Tris缓冲盐溶液漂洗。加入10%驴血清37℃孵育1 h，分别加入用10%驴血清稀释的兔抗PV（1∶200）、NPY（1∶800）、SOM（1∶500）、GAD65/67（1∶500）和小鼠抗c-Fos（1∶500）一抗，4 ℃孵育过夜。 复温1 h后漂洗，加入Alexa Fluor 488标记驴抗兔和Alexa Fluor 488标记驴抗小鼠二抗，37℃孵育1 h，再次避光漂洗，风干后用含DAPI的抗荧光淬灭封片液封片。蔡司光学显微镜下摄取5倍拼图和10倍局部图像，用Photoshop计算DG、CA1、CA3区上述指标的阳性细胞数或阳性面积。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析；组间两两比较，满足方差齐性时采用SN-K检验，方差不齐时采用Dunnett's T3检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠PWTs比较 造模前各组大鼠基础PWTs差异无统计学意义（P＞0.05）。 从造模后1 d至实验结束，模型对照组大鼠PWTs均显著低于空白对照组（P＜0.01）。 在造模后26～28 d电针介入后，电针治疗组大鼠PWTs较模型对照组显著升高（P＜0.01），但仍低于空白对照组（P＜0.01）。假电针治疗组大鼠PWTs与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组大鼠PWTs变化情况Fig.1 The changes of the PWTs in each group

2.2 各组大鼠焦虑行为比较 和空白对照组比较，模型对照组大鼠进入开放臂运动距离、开放臂停留时间和开放臂进入次数显著减少（P＜0.01）；与模型对照组比较，电针治疗组大鼠进入开放臂运动距离、开放臂停留时间和开放臂进入次数均显著增加（P＜0.01）。假电针对各项指标均无明显的干预作用。各组大鼠的总运动距离差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。结果显示，模型对照组大鼠具有明显的焦虑行为，电针介入能有效缓解大鼠的焦虑行为。

图2 各组大鼠的EZM行为学结果Fig.2 The behavior results of the EZM in each group

2.3 各组大鼠双侧海马c-Fos表达比较 对于DG区，与空白对照组比较，模型对照组双侧c-Fos阳性细胞表达明显减少（P＜0.01）；与模型对照组比较，电针治疗组双侧c-Fos阳性细胞表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与电针治疗组比较，假电针治疗组显著减少（P＜0.01）。

对于CA1区和CA3区，与空白对照组比较，模型对照组双侧c-Fos阳性细胞表达明显减少（P＜0.01，P＜0.05）；与模型对照组比较，电针治疗组差异无统计学意义（P＞0.05）；与电针治疗组比较，假电针治疗组差异无统计学意义（P＞0.05）。 见图3。

图3 各组c-Fos阳性细胞表达Fig.3 c-Fos positive cells in each group

2.4 各组大鼠双侧海马GAD65/67阳性面积比较 对于DG区，与空白对照组比较，模型对照组健侧GAD65/67阳性面积增大（P＜0.05），患侧差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型对照组比较，电针治疗组双侧GAD65/67阳性面积差异无统计学意义（P＞0.05）；与电针治疗组比较，假电针治疗组双侧GAD65/67阳性面积显著增大（P＜0.01）。

对于CA1区和CA3区，各组大鼠双侧GAD65/67阳性面积差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

图4 各组GAD65/67阳性面积Fig.4 GAD65/67 positive area in each group

2.5 各组大鼠双侧海马NPY阳性细胞比较 对于DG区，与空白对照组比较，模型对照组双侧NPY阳性细胞明显增多（P＜0.05）；与模型对照组比较，电针治疗组双侧NPY阳性细胞显著减少（P＜0.01）；与电针治疗组比较，假电针治疗组双侧NPY阳性细胞显著增多（P＜0.01）。

对于CA1区，与空白对照组比较，模型对照组双侧NPY阳性细胞明显增多（P＜0.01）；与模型对照组比较，电针治疗组双侧NPY阳性细胞显著减少（P＜0.01）；与电针治疗组比较，假电针治疗组健侧NPY阳性细胞显著增多（P＜0.05），假电针治疗组患侧差异无统计学意义（P＞0.05）。

对于CA3区，与空白对照组比较，模型对照组双侧NPY阳性细胞明显增多（P＜0.01）；与模型对照组比较，电针治疗组健侧NPY阳性细胞无显著差异（P＞0.05），患侧显著减少（P＜0.01）；与电针治疗组比较，假电针治疗组健侧NPY阳性细胞差异无统计学意义（P＞0.05），患侧显著增多（P＜0.01）。 见图5。

图5 各组大鼠NPY阳性细胞表达Fig.5 NPY positive cells in each group

2.6 各组大鼠双侧海马PV与SOM阳性细胞数量比较在DG、CA1和CA3区，各组PV与SOM阳性细胞数量差异均无统计学意义（P＞0.05）。 见图6、7。

图6 各组PV阳性细胞表达Fig.6 PV positive cells in each group

图7 各组SOM阳性细胞表达Fig.7 SOM positive cells in each group

3 讨论

慢性疼痛患者易伴发焦虑、抑郁等情绪障碍。CFA诱导的慢性炎性痛模型是目前应用最广泛的慢性炎性痛模型，其产生的炎性痛稳定而持久，便于研究疼痛及其伴发的情绪异常。本研究中，造模后1～28 d观察到大鼠PWTs显著下降，提示造模成功。EZM实验是评估啮齿类动物焦虑样状态的经典行为学方法之一[21]。本研究提示，造模后1～28 d时模型对照组大鼠PWTs显著降低，在EZM中进入开放臂次数、时间、运动距离显著减小，与研究结果相似[22]。电针干预能起到镇痛和抗焦虑情绪的作用，具体表现在PWTs增加，进入开放臂次数和时间增加等，与课题组既往的研究结果相吻合[23]。

海马是参与疼痛信号处理的重要脑区之一[9，24]，也是情绪加工神经环路的重要组成部分，能够整合加工情绪信息[25]。慢性疼痛可能通过改变海马的结构或者功能活动，进而对患者的情绪和认知功能产生影响[26]。海马不同分区有不同的功能，这些区域共同参与海马疼痛信号处理和情绪控制环路。本研究选择DG、CA1和CA3三个区域作为检测区域。c-Fos被认为是神经活动和痛觉处理的标记物[27]，多项研究探索过疼痛相关c-Fos的表达，但呈现结果却大不相同。Aloisi等[28]研究发现，注射甲醛后大鼠海马DG区c-Fos显著增加。Funahashi等[29]发现，对大鼠左下切牙进行有害机械牙髓刺激，海马双侧CA1区c-Fos表达受到抑制。本研究观察到，模型对照组大鼠双侧海马各区c-Fos阳性细胞表达均减少，这表明海马神经元活性在慢性炎性痛模型中被抑制，而电针无治疗作用则提示电针治疗慢性痛及伴发情绪障碍可能与调控海马层面c-Fos阳性细胞表达无关。

大脑的功能正常有赖于兴奋性、抑制性神经递质的平衡，即需要GABA抑制性神经递质和Glu兴奋性神经递质保持平衡[30]。GABA能神经元作为中枢神经系统主要的抑制性神经元，其功能障碍与疼痛发生机制和焦虑样行为密切相关[31-32]。GABA由GABA能神经元中GAD合成，GAD的两种亚型GAD65和GAD67，是两个独立基因的产物[33]。SOM、PV和NPY中间神经元是GABA中间神经元的三种主要亚型[17]。SOM是一种内源性非阿片类神经肽，具有镇痛作用[34]。PV神经元在中枢系统分布广泛，Kang等[35]研究发现，ACC中PV神经元特异性激活后，可以缓解由CFA造成的机械超敏反应。在本研究中，模型对照组海马各区GAD、SOM、PV表达均无明显变化，电针治疗组大鼠海马各区GAD、SOM、PV表达相较于模型对照组无明显变化。因此，笔者猜测海马水平的GAD、SOM、PV未参与慢性炎性痛模型大鼠的疼痛及伴发焦虑情绪形成，因此电针干预对其表达也未起到调节作用。

NPY是所有哺乳动物中枢和外周神经系统中一种高度保守的内源性肽，与慢性疼痛密切相关[36]。Okabe等[37]研究提示，坐骨神经慢性收缩性损伤的大鼠神经性疼痛模型中，下丘脑弓状核中NPY表达下降。潘集阳等[38]发现，高剂量咖啡因诱导大鼠产生焦虑样行为，其海马NPY表达显著增多。本研究中，模型对照组大鼠海马各区域NPY阳性细胞表达均上调，由此猜测海马水平的NPY参与慢性炎性痛模型大鼠的疼痛及其相关负性情绪形成。已有研究表明，对于CFA诱导的慢性炎性痛模型大鼠，电针治疗可能通过影响脊髓组织中NPY的表达，从而发挥抗伤害作用，改善疼痛感受[39]。本研究中，电针治疗后大鼠海马NPY阳性细胞表达显著下降，由此推断，电针干预慢性炎性痛模型大鼠可能通过下调海马层面NPY表达水平，调节疼痛及情绪障碍。

综上所述，通过建立CFA慢性炎性痛模型，观察大鼠PWTs、焦虑样行为，本研究发现慢性炎性痛大鼠海马各区域NPY表达增加，而电针治疗显著降低NPY表达，并能够有效缓解大鼠疼痛和焦虑样行为。因此，电针对CFA诱导的慢性炎性痛的镇痛和抗焦虑作用可能与下调海马CA1、CA3和DG区NPY阳性细胞表达相关。