何萍 徐瑞 姜璐 王维平

慢性肾功能不全患者常伴有多种并发症，其中心血管疾病和感染合计占慢性肾功能不全患者死亡总数的70%，两者与免疫反应改变直接或间接相关[1]。血液透析是慢性肾功能不全患者进展至终末期肾病时常用的肾替代治疗方法，维持性血液透析（Maintenance hemodialysis，MHD）患者常存在免疫功能异常[2]，表现为T淋巴细胞功能障碍。另外，MHD患者亦存在红细胞免疫功能异常，这些免疫功能紊乱与MHD患者多种并发症有关。微炎症状态、继发性甲状旁腺功能亢进（Secondary hyperparathyroidism，SHPT）是透析患者常见并发症，且严重影响患者生存质量，增加心血管疾病风险。而维生素D作为免疫调节激素，对慢性肾脏病患者免疫功能具有重要作用。帕立骨化醇是一种选择性维生素D受体激动剂，临床研究已证实其在治疗MHD伴SHPT方面有确切疗效[3～6]，但目前关于其对免疫功能的影响研究不多。为此，本研究观察帕立骨化醇用于MHD患者治疗SHPT的同时对红细胞免疫功能和T细胞亚群的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年12月～2021年8月在我院血液净化中心行MHD治疗的患者，纳入标准：①接受血液透析治疗超过1年；②年龄18～75岁；③病情稳定，无恶性肿瘤、急性心脑血管疾病、急性感染等；④600pg/ml＜甲状旁腺素（Parathyroid hormone，PTH）＜1 000pg/ml、血 钙＜2.55mmol/L，服用骨化三醇或含钙磷结合剂者经过2周的药物洗脱期；⑤不存在铁缺乏状态：铁蛋白水平≥200μmol/L，血清铁饱和度≥20%；⑥未使用免疫抑制剂等影响免疫功能的药物；⑦稳定使用肾性贫血药物6个月以上。排除标准：①入选前3个月应用西那卡塞、双磷酸盐等药物；②严重肝脏疾病；③静脉使用铁剂者。共纳入60例MHD伴SHPT患者作为研究组，男37例，女23例，年龄29～71岁，平 均（56.26±9.33）岁。原 发病 为慢性肾炎30例，糖尿病肾病12例，痛风性肾病2例，多囊肾病2例，高血压肾损害3例，梗阻性肾病2例，其他9例。同时，根据性别、年龄、透析龄配对选择血红蛋白和PTH达标的MHD患者45例作为对照组，根据相关指南[7，8]血红蛋白靶目标控 制在110～130g/L，PTH控制 在150～300pg/ml，原发病为慢性肾炎22例，糖尿病肾病10例，痛风性肾病2例，多囊肾病2例，高血压肾损害2例，梗阻性肾病1例，其他6例。本研究经我院伦理委员会审查同意，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 透析治疗方法 所有患者均采用碳酸氢盐透析液规律血液透析，每次4h，透析频率每周3次，血流量200～250ml/min，采用低分子肝素抗凝，透析器为聚砜膜，面积1.8m2。

1.2.2 帕立骨化醇治疗方法 研究组PTH理想控制目标为150～300pg/ml，使用江苏恒瑞医药股份有限公司生产的帕立骨化醇，商品名瑞可林，规格5μg/支，透析结束时经由血液透析通路给药，根据药品说明书并结合药品规格使用、调整剂量，尽量不浪费药品。起始剂量0.04～0.1μg/kg，一般5μg/次，单次注射，给药频率每周2～3次。剂量调整：①4周后PTH较基线不变或上升，或下降＜30%，将帕立骨化醇增加5μg，每次增加或隔次增加；②如30%＜PTH较基线下降＜60%则维持原有剂量；③如PTH较基线下降＞60%或PTH＜150pg/ml则每次减少或隔次减少5μg。

1.2.3 其他药物治疗方法 研究期间患者原使用药物如降压药、促红细胞生成素以及口服铁剂、维生素B12、叶酸等按照原有途径和剂量使用，治疗过程中原则上不做调整。

1.2.4 临床指标测定 于透析日清晨采集空腹肘静脉血10ml，离心后吸取上清液待检，采用全自动血细胞分析仪检测中性粒细胞计数、淋巴细胞计数和血红蛋白水平，计算中性粒细胞淋巴细胞比值（Neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）；采用全自动生化免疫分析仪检测肝功能、电解质、PTH、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）及免疫球蛋白IgA、IgG、IgM等；采用全自动酶联免疫分析仪测定炎症指标白介素6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）；通过流式细胞仪测定外周血T淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+。研究组于治疗前及治疗12周后分别测定上述指标，并根据治疗监测频率检测血常规、肝功能、PTH和电解质，对照组仅入组时检测上述指标。

1.2.5 红细胞膜C3b受体花环率（Red blood cell C3b receptor rosette rate，RBC-C3bRR）和红细胞免疫复合物花环率（Red blood cell immune complex rosette rate，RBC-ICR）测定 采用红细胞酵母花环法测定RBCC3bRR和RBC-ICR，抽取空腹状态下抗凝血1ml，用生理盐水稀释后离心、清洗，配成1.25×107/ml的红细胞悬液，其余血液离心沉淀并分离出血浆备用。分别取0.05ml配成的红细胞悬液2份，1份加自身血浆0.05ml，并加入0.05ml（1×108/ml）酵母多糖混匀；另外1份加入0.05ml酵母多糖，再加入生理盐水0.05ml混匀。2份混匀标本均37℃水溶30min，然后加入0.25%戊二醛0.05ml混匀，取0.05ml进行水平涂片，吹干，加甲醇固定，瑞氏染色，然后于高倍显微镜下计数200个红细胞，1个红细胞结合2个或2个以上酵母多糖为1个花环，分别计算2份标本花环率得到RBC-C3bRR和RBC-ICR。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计数资料用频数和百分比表示，组间比较采用χ2检验，正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组与对照组一般资料比较 两组患者性别、年龄、透析龄相比，差异无统计学意义（P＞0.05），研究组血红蛋白、RBC-C3bRR、IgA、IgM、IgG、CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均低于对照组，而RBC-ICR、CD8+和PTH均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组患者一般资料比较（±s）

表1 两组患者一般资料比较（±s）

项目 研究组（n=60）对照组（n=45）χ2/t P性别（男/女） 37/23 28/17 0.021 0.885年龄（岁） 56.26±9.33 55.17±11.91 0.526 0.600透析龄（月） 51.67±12.36 49.65±10.87 0.872 0.385血红蛋白（g/L） 104.8±11.9 115.7±9.7 5.018 0.000 RBC-C3bRR（%）10.21±1.24 16.38±1.89 19.040 0.000 RBC-ICR（%） 14.15±1.07 8.97±0.95 25.741 0.000 IgA（g/L） 1.85±0.37 2.17±0.45 3.996 0.000 IgM（g/L） 0.96±0.29 1.39±0.39 6.218 0.000 IgG（g/L） 6.47±1.25 9.12±1.65 9.008 0.000 CD3+（%） 69.97±9.05 78.21±13.77 3.489 0.000 CD4+（%） 38.02±4.05 49.28±6.32 10.450 0.000 CD8+（%） 29.56±8.83 26.06±7.91 2.101 0.038 CD4+/CD8+1.43±0.55 1.84±0.51 3.899 0.000 PTH（pg/ml） 723.07±108.33 236.92±56.89 29.723 0.000

2.2 研究组治疗前后生化指标比较 治疗12周后，研究组患者碱性磷酸酶（AKP）、血磷及PTH均较治疗前下降，而血钙水平较治疗前升高（P＜0.05）；白蛋白（ALB）水平在治疗前后差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 研究组治疗前后炎症指标和红细胞免疫功能比较 治疗12周后，研究组患者炎症指标CRP、NLR、IL-6和TNF-α均下降，红细胞计数、血红蛋白及RBC-C3bRR均升高，而RBC-ICR则下降，与治疗前相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 研究组治疗前后免疫功能比较 治疗12周后，研究组患者IgA、IgM和IgG均升高（P＜0.05），CD4+、CD3+及CD4+/CD8+升高，而CD8+下降，与治疗前相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表2 研究组治疗前后生化指标比较（±s）

表2 研究组治疗前后生化指标比较（±s）

时间 AKP（U/L） ALB（g/L） 钙（mmol/L） 磷（mmol/L） PTH（pg/ml）治疗前 135.91±28.72 38.56±5.19 2.26±0.24 2.51±0.49 723.07±108.33治疗后 119.87±23.92 40.23±6.71 2.45±0.31 1.91±0.52 567.23±237.12 t 3.324 1.525 3.754 6.505 4.631 P 0.001 0.130 0.000 0.000 0.000

表3 研究组治疗前后炎症指标和红细胞免疫功能比较（±s）

表3 研究组治疗前后炎症指标和红细胞免疫功能比较（±s）

时间 红细胞计数（×109/L）血红蛋白（g/L）RBC-C3bRR（%）RBC-ICR（%）CRP（mg/L） NLR IL-6（pg/ml）TNF-α（pg/ml）治疗前 3.23±0.49 104.8±11.910.21±1.2414.15±1.0716.41±4.30 4.41±1.20 87.49±16.7026.51±7.29治疗后 3.46±0.55 109.3±10.315.19±1.45 9.25±0.84 10.30±3.91 3.79±0.89 71.81±17.8922.40±8.89 t 2.419 2.215 20.219 27.902 8.139 3.098 4.968 2.759 P 0.017 0.029 0.000 0.000 0.000 0.002 0.000 0.007

表4 研究组治疗前后免疫功能比较（±s）

表4 研究组治疗前后免疫功能比较（±s）

时间 IgA（g/L） IgM（g/L） IgG（g/L） CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+治疗前 1.85±0.37 0.96±0.29 6.47±1.25 69.97±9.05 38.02±4.05 29.56±8.83 1.43±0.55治疗后 2.05±0.43 1.12±0.33 8.29±1.51 73.93±8.26 44.39±5.54 26.10±7.60 1.80±0.65 t 2.731 2.821 7.192 2.503 7.128 2.301 3.366 P 0.007 0.006 0.000 0.014 0.000 0.023 0.001

3 讨论

由于我国目前肾源匮乏，限制了肾移植手术治疗的开展，肾替代治疗尤其是血液透析仍然是临床上最常用的治疗终末期肾病的有效手段。MHD患者存在多系统功能紊乱，受多种致病因子的综合影响，除普遍存在贫血外，尚存在免疫功能紊乱。尿毒症毒素、营养不良、慢性炎症、维生素D-甲状旁腺激素轴改变以及透析治疗等因素均影响患者免疫功能。SHPT是终末期肾病常见症状，以高PTH血症、钙磷代谢紊乱和维生素D紊乱为特点。中国透析预后与实践模式研究（DOPPS）数据显示MHD患者中PTH＞300pg/ml者占44.5%。PTH及其相关受体存在于人体众多组织中，几乎所有器官都是其作用的靶器官。T淋巴细胞表面有特异性PTH受体表达，PTH可作用于MHD患者T淋巴细胞，引起进入淋巴细胞的钙离子增多以及蛋白激酶激活，使T淋巴细胞和B淋巴细胞受到损害，抑制淋巴细胞转化，对细胞免疫以及体液免疫产生影响。表现为T淋巴细胞总数尤其CD4+数量显著下降，B淋巴细胞产生免疫球蛋白能力下降[9]。T细胞重要功能是介导细胞免疫并调节机体免疫功能，是最重要的免疫细胞，其功能异常是MHD患者免疫功能紊乱的重要机制[10]。研究表明，SHPT患者行甲状旁腺手术后，T淋巴细胞增生和B淋巴细胞产生免疫球蛋白能力得到改善[11]。据此，推测应用帕立骨化醇治疗SHPT的同时可能会改善MHD患者免疫功能。

红细胞是运输氧气的主要媒介，具有强大免疫功能，其免疫功能是MHD患者抗感染的因素之一。红细胞表面存在补体受体，可结合补体C3及循环免疫复合物，红细胞通过膜表面的C3b受体与C3b相黏附，有利于清除机体异物，稳定内环境；在疾病状态下，红细胞可能会失去其抗氧化能力并释放损伤相关的分子模式，从而导致先天免疫和适应性免疫的调节[12]。而尿毒症患者由于毒素抑制补体受体活性，并且红细胞免疫抑制因子物质增多，加上红细胞生成减少，影响红细胞膜的稳定性，导致红细胞免疫功能低下，呈现RBC-C3bRR较正常人下降，而RBC-ICR升高。研究显示，单次血液透析治疗后RBC-C3bRR升高，RBC-ICR下降，但仍未恢复正常[13]。T细胞执行特异性细胞免疫及调节功能，CD4+细胞和CD8+细胞是两种主要的T细胞亚群，CD3+、CD4+主要起辅助作用，通过免疫细胞因子的分泌调节免疫反应，而CD8+主要抑制淋巴细胞产生抗体来调节免疫反应。CD4+/CD8+细胞比值一定程度上反映机体细胞免疫反应的平衡状况，维持CD4+与CD8+平衡是机体免疫系统内环境稳定的中心环节。

本研究结果显示，MHD患者中贫血控制达标且PTH控制达标患者免疫功能状态指标优于SHPT患者，伴SHPT的MHD患者存在免疫功能紊乱。应用帕立骨化醇治疗12周后，MHD患者PTH、血磷下降，血钙升高，AKP下降（P＜0.05），与此同时，RBC-C3bRR上升而RBC-ICR下降，提示帕立骨化醇在纠正MHD患者SHPT同时，改善了红细胞免疫功能，这可能也促进了贫血的改善。另外，治疗后免疫功能指标CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IgM、IgG和IgA均较治疗前升高，提示患者T细胞功能改善，由此可推断MHD患者伴SHPT是影响T细胞亚群及红细胞免疫功能的重要因素。

MHD患者由于尿毒症毒素在体内蓄积、酸碱失衡会对机体免疫系统造成损害，导致T淋巴细胞功能异常及免疫球蛋白水平下降。PTH升高可导致终末期肾病患者红细胞免疫功能紊乱及贫血，而红细胞具有调控T淋巴细胞免疫功能、B淋巴细胞产生免疫球蛋白等作用。研究表明，MHD患者RBC-C3bRR与CD4+/CD8+呈正相关[13]。慢性肾衰竭患者T淋巴细胞明显失衡，CD3+、CD4+均低于健康人群而CD8+高于健康人群[14]。SHPT患者PTH增加，可抑制E玫瑰花环形成以及正常淋巴细胞增殖反应，从而抑制淋巴细胞转化作用，导致机体免疫抑制，降低免疫应答。维生素D是机体重要的调节内分泌免疫的激素，可增强淋巴细胞功能，诱导CD4+产生，发挥免疫应答效应。终末期肾病患者普遍存在维生素D不足，帕立骨化醇是一种维生素D类似物，其除具有调节钙磷代谢作用外，还可以抑制肾素血管紧张素醛固酮系统，减少炎症因子的分泌[15]。因此，改善SHPT可能会改善MHD患者红细胞免疫功能和机体免疫功能状态。另外，本研究结果显示，经过帕立骨化醇治疗后，SHPT患者炎症指标CRP、NLR、IL-6和TNF-α均下降（P＜0.05），提示帕立骨化醇有效治疗SHPT的同时改善了炎症状态，有利于进一步改善红细胞免疫和体液免疫。

综上所述，MHD伴SHPT患者存在红细胞免疫功能和T细胞亚群异常，帕立骨化醇在有效治疗SHPT的同时，对MHD患者红细胞免疫功能、免疫球蛋白和T细胞亚群均有改善作用。