肖海平 朱志伟

新生儿脓毒症是临床早产儿出现死亡及并发症的主要原因之一，足月新生儿脓毒症发病率相对较低，但仍有较高的严重不良结局风险。相关研究认为，脓毒症在第三阶段（脓毒性休克期）患儿已经出现明显低血压所致的灌注异常，此时患儿死亡率达30%～50%[1]，预后较差。由于脓毒症可诱发全身免疫应答，炎症反应的过激表达使血清中中性粒细胞数量急剧增加，中性粒细胞发挥免疫作用的机制包括直接胞内吞噬、脱颗粒作用后启动非氧杀菌和释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）[2]。有学者证明，NETs作为一种组蛋白和抗菌蛋白修饰的网状DNA结构，在病原微生物控制播散及清除中有重要作用[3]，但过量的NETs会诱发炎症瀑布反应导致吞噬细胞功能下降，加重炎性损伤，继而使脓毒症患者出现肝损伤[4]，本研究旨在探讨脓毒症并发肝损伤患儿NETs浓度特点，借此评估NETs在疾病发展中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料 依据病例对照研究方式，收集2019年10月～2021年6月于我院诊断为脓毒症的新生儿25例为观察1组，25例脓毒症并肝损伤新生儿为观察2组，同期入院检查的53例健康新生儿为对照组。入院后丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高至正常范围高值2倍以上，天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBil）或碱性磷酸酶中至少一项升高幅度超过正常值2倍判定为肝损伤。单纯脓毒症患儿及合并肝损伤患儿均有不同程度体温改变、心率增快、呼吸频率改变等，均有喂养反应异常及活力异常。三组新生儿性别、受检时日龄、出生时体重、分娩方式比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有良好的均衡可比性;观察1组和观察2组在脓毒症诱发因素、母亲合并病毒性肝炎、感染病原菌方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

续表1

1.2 纳入标准 ①经血培养结果确认为脓毒症；②日龄＜60天；③对照组均无任何病史；④患儿家属知情同意；⑤经医学伦理委员会批准。

1.3 排除标准 ①母亲携带人免疫缺陷病毒或合并获得性免疫缺陷综合征；②因其他疾病导致的肝损伤；③药物性肝损伤；④原发性胆道疾病；⑤先天性肝脏发育障碍。

1.4 方法 统一条件下采集所有新生儿空腹静脉血，以全自动生化分析仪检测ALT及TBil。外周血NETs定量检测以NETs组成结构中主要成分-双链DNA（dsDNA）浓度作为NETs浓度，取4ml外周静脉血于EDTA抗凝管，应用PicoGreen荧光染料进行dsDNA的定量检测。

NETs激发时间测定：先分离中性粒细胞，采集10ml外周静脉血，离心管内准备5ml中性粒细胞分离液，取5ml血液叠加于分离液表面，离心40min；将管内粒细胞层收集完全后置入M199培养基中，在细胞渗透压恢复后进行离心，去除上清液，M199培养基（5ml）重悬进行细胞沉淀，后离心5min；弃上清液，添加红细胞裂解液后放于冰上裂解10min，离心；再次弃上清液，用M199培养基重悬，混匀后离心；弃上清液，细胞沉淀仍用培养基重悬；以台盼蓝进行染色，取纯化中性粒细胞。通过外物刺激中性粒细胞，刺激物选择乙酸肉豆蔻佛波醇或N-甲酰-L-甲硫酰胺-L-白氨酰-L-苯丙氨酸，用量以中性粒细胞产生NETs为宜，记录NETs开始产生时间。

1.5 观察指标 比较各组肝功能指标（ALT、TBil）及中性粒细胞相关参数（中性粒细胞计数、NETs）；根据《临床儿科学》中关于儿童脓毒症诊断与分期标准[5]，将脓毒症新生儿分为脓毒症、严重脓毒症及脓毒性休克三组，并比较三组患儿的中性粒细胞计数及NETs；比较脓毒症早产儿及足月儿的中性粒细胞相关参数。

1.6 统计学分析 数据均录入SPSS 22.0软件进行处理，不同组别肝功能指标及中性粒细胞参数比较采用重复测量数据方差分析，计量资料行t检验，计数资料行秩和检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 各组肝功能指标及中性粒细胞相关参数比较 观察1组、2组患儿ALT、TBil及中性粒细胞计数、NETs浓度均明显高于对照组，且观察2组上述指标水平明显高于观察1组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.2 不同分期脓毒症患儿中性粒细胞计数及NETs比较 脓毒性休克组及严重脓毒症组患儿中性粒细胞计数、NETs浓度均显著高于脓毒症组，且脓毒性休克组上述指标水平显著高于严重脓毒症组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.3 不同胎龄脓毒症患儿中性粒细胞相关参数比较 早产儿中性粒细胞计数及NETs浓度均低于足月儿，NETs形成时间长于足月儿，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表2 各组肝功能指标及中性粒细胞参数比较（±s）

表2 各组肝功能指标及中性粒细胞参数比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与观察1组比较，bP＜0.05

组别 ALT（U/L）TBil（μmol/L）中性粒细胞计数（×109/L）NETs（%）观察1组（n=25） 60.94±10.28a27.08±4.54a 19.67±4.67a39.87±4.15a观察2组（n=25） 103.21±8.17ab65.27±3.71ab30.27±9.47ab44.64±4.78ab对照组（n=53） 52.34±8.63 18.41±3.28 7.31±1.08 0.98±0.07 F 281.377 1374.718 172.279 2293.012 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 不同分期脓毒症患儿中性粒细胞计数及NETs比较（±s）

表3 不同分期脓毒症患儿中性粒细胞计数及NETs比较（±s）

注：与脓毒症组比较，aP＜0.05；与严重脓毒症组比较，bP＜0.05

组别 中性粒细胞计数（×109/L） NETs（%）脓毒症组（n=30） 50.17±10.71 38.78±4.57严重脓毒症组（n=16） 57.28±10.28a 42.01±5.27a脓毒性休克组（n=4） 70.12±6.05ab 49.78±3.18ab F 7.729 10.445 P 0.001 0.000

表4 不同胎龄脓毒症患儿中性粒细胞相关参数比较（±s）

表4 不同胎龄脓毒症患儿中性粒细胞相关参数比较（±s）

组别 中性粒细胞计数（×109/L） NETs（%） NETs形成时间（h）早产儿（n=31） 21.09±7.51 30.61±4.85 4.43±1.02足月儿（n=19） 30.28±9.87 40.30±6.84 2.36±0.49 t 3.723 5.857 8.257 P 0.000 0.000 0.000

3 讨论

3.1 新生儿脓毒症可出现ALT及TBil水平异常升高 本研究中脓毒症患儿ALT及TBil水平均高于健康新生儿（P＜0.05），初步提示无论是否明确合并肝损伤，脓毒症患儿均可出现肝功能下降，合并肝损伤后肝脏功能减退更加明显。从炎症介质介导的肝微循环障碍及氧自由基过氧化导致的肝损伤角度分析原因：新生儿脓毒症是指细菌或真菌在新生儿娩出前、娩出过程中或娩出后经各种途径进入新生儿血液循环并在其中生长繁殖后造成的中毒反应，患儿机体中大量细菌代谢产物及内毒素释放入血，机体对此作出的早期反应可能上升至炎症介质瀑布状态，各类炎性介质短时间内分泌增加且氧自由基水平增高，而肝脏参与人体解毒及免疫防御，内毒素、代谢产物、炎性因子、氧自由基等大量积聚于肝脏引起肝细胞损伤，因此脓毒症后肝脏是最易受累的器官之一。在严重肝损伤期，中性粒细胞被招募到病灶区的情况减少，反而会诱发非感染部位的组织损伤，继而导致多个脏器功能受损；在肝损伤后进一步干扰胆汁代谢进程，中性粒细胞分泌的NETs抑制脓毒症期的淋巴细胞计数，机体往往存在免疫功能障碍，致使TBil水平增高，因此，肝损伤后可出现ALT增高，胆汁代谢障碍后则可出现TBil浓度增高，前者能反映肝细胞损伤程度，后者能较好地反映肝功能减退程度，评估肝功能指标可以初步判断患儿预后。另有研究针对成年脓毒症患者进行死亡风险因素分析，认为脓毒症并发肝损伤是脓毒症患者死亡的独立风险因素[6]，亦证实本研究结果的可靠性。

3.2 脓毒症患儿中性粒细胞计数及NETs变化的临床意义 本研究显示观察1组、2组患儿中性粒细胞计数、NETs浓度均明显高于对照组，不同脓毒症分期患儿的中性粒细胞计数、NETs水平差异显著，以脓毒性休克患儿的症状最为严重（P＜0.05），提示感染发生后患儿免疫系统激发了大量的中性粒细胞。结合中性粒细胞NETs的生理作用分析其表达水平对脓毒症肝损伤的可能影响机制：①中性粒细胞是人体与生俱来的第一道免疫防线，具有强大的吞噬能力及趋化作用，在机体以各类炎性细胞激活对脓毒症发出免疫防御反应中扮演重要角色，但在脓毒症时期，中性粒细胞的募集反而会造成肝损伤及胆汁淤积，本研究中患儿的ALT水平及TBil浓度异常升高。同时淋巴细胞是患儿机体适应性免疫的主要部分，其分泌水平与皮质醇、神经内分泌应激有关，因此中性粒细胞的变化往往反映不受抑制的炎症反应，加重脓毒症，同时也代表潜在的免疫途径。②中性粒细胞免疫作用中除直接吞噬外，在炎性介质、应激等作用下中性粒细胞可发生NETosis凋亡方式，核膜、胞质颗粒膜均发生溶解，导致染色质、胞浆颗粒产生接触并在胞膜破裂后排放至细胞外，这种向细胞外释放的纤维网状结构物质为NETs。组蛋白、中性粒细胞源性循环DNA、蛋白酶颗粒（如乳铁蛋白、髓过氧化物酶、溶菌酶等）组成该结构框架，NETs能捕捉并杀灭病原菌，构成中性粒细胞另一重要的抗感染方式。脓毒症患儿感染部位召集了大量中性粒细胞，NETs以物理黏附方式聚集于病原微生物周围，限制病原体扩散后暴露于抗菌药物作用范围内，增强药物治疗效果[7]；其次NETs成分组成结构中包含的抗菌蛋白能直接杀灭病原体，如组蛋白是NETs结构中含量最高的蛋白，其杀菌能力是其他同等剂量杀菌剂的100倍[8]，髓过氧化物酶对次氯酸的形成有催化作用，高水平次氯酸可清除病原菌，乳铁蛋白能隔离病原微生物繁殖所需的离子基团，进而限制其生长，因此较高水平的NETs有利于脓毒症感染控制[9]。通过检测外周血NETs表达水平亦可作为脓毒症严重程度的评估指标之一。③研究表明[10]，NETs存在一定细胞毒性作用，尽管NETs结构中的组蛋白、髓过氧化物酶、丝氨酸蛋白酶等对病原体有杀灭效果，但对正常细胞亦有影响，如组蛋白对细胞有毒性，丝氨酸蛋白酶能分解正常细胞外基质蛋白后损伤组织，髓过氧化物酶催化形成的次氯酸则能损害细胞膜完整性；而且NETs在肝脏的肝窦位置能固定存活24h左右[11]，致使局部损伤集中，肝脏细胞毒性损害愈加明显。本研究中观察2组患儿NETs水平高于其他两组，因此NETs对于脓毒症患儿而言具有双重作用。有研究发现，NETs能加速凝血进程，血小板聚集后血栓形成风险增加，降低微血管灌注后引起血管内皮损伤，联合NETs毒性作用共同引起患儿上皮细胞、内皮细胞等损害与死亡，加重患儿病情[12]。提示在新生儿脓毒症治疗中应注意NETs浓度改变，及时检测各器官功能状态，在恰当时机予以干预，既保留NETs清除病原菌的能力，又能控制其对正常组织的侵害深度。

3.3 中性粒细胞相关参数对早产的影响 本研究结果显示早产脓毒症患儿NETs形成时间明显长于足月患儿且NETs浓度低于足月患儿，表明发生感染的新生儿胎龄越小，NETs产生越延迟，且水平越低，分析原因可能与早产儿中性粒细胞、NETs调节机制尚不成熟有关。早产儿NETs形成延迟意味着中性粒细胞整体杀菌能力低下，而中性粒细胞作为新生儿时期最主要的免疫细胞不能有效发挥作用后，对患儿感染控制及预后极其不利。高雪锋等[13]认为新生儿中性粒细胞数量虽多但NETs形成能力较低，致使胞内杀菌能力正常但胞外杀菌能力较弱，导致中性粒细胞整体杀菌能力低于正常成年人。另有研究显示足月新生儿的中性粒细胞在接受脂多糖刺激后2h产生少量NETs，早产儿则完全不能形成[14]，均表明了不同胎龄新生儿产生NETs能力的差异。因此针对脓毒症早产新生儿应及时干预、促进活化进程[15]。

综上所述，脓毒症肝损伤新生儿中性粒细胞水平可出现明显升高，NETs浓度亦明显增高，早产儿NETs形成时间较晚。NETs浓度的变化一方面表明该物质参与感染控制，一方面提示对机体正常细胞损害加重，可叠加肝脏损伤危险。