郄智萍 周洁 庄晓丹 杜日昌 刘建 李泛湘 张柳萍 刘贞 陈岩 胡红波

林奇综合征（Lynch syndrome，LS）是一种常染色体显性遗传性疾病，易发生恶性肿瘤，包括结直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌等。其中约50%的LS女性患者会最先发生子宫内膜癌，因此子宫内膜癌又被视为前哨癌[1]。研究显示，林奇综合征相关子宫内膜癌（Lynch syndrome associated endometrial cancer，LS-EC）患者在10年内发生第2次恶性肿瘤的风险约为25%，15年内约为50%[2]。开展对子宫内膜癌患者的筛查，有利于早期发现、早期干预林奇综合征患者。目前我国尚未建立成熟的筛查手段和完善的基因检测指南，对LS-EC患者基因诊断的研究也较少。通过对高风险人群进行筛查，既可预防患者再次发生其他LS相关肿瘤，也有利于家族中其他成员规避LS相关肿瘤的风险，尽早采取相应的预防性措施。本研究旨在探索错配修复（Mismatch repair，MMR）蛋白表达结合患者LS相关肿瘤个人史或家族史在子宫内膜癌患者中初筛林奇综合征的应用价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究纳入2019年1月～2020年12月在我院经病理学诊断确诊为EC的147例患者。纳入标准：①有病理学确诊证据，患者病理组织标本均采用免疫组化（IHC）检测MMR蛋白表达；②有详细的FIGO分期、手术治疗方案及辅助治疗方案；③有完善的临床资料，包括患者个人和家族有无LS相关肿瘤等信息。排除标准：①外院完成全子宫+双附件切除手术治疗患者；②临床资料、病理资料不全患者；③术前行新辅助放、化疗患者；④复发型EC患者；⑤未行子宫内膜癌分期手术治疗患者。本课题已获医院伦理委员会通过，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 对147例确诊为EC患者的病理切片进行MLH1/PMS2/MSH2/MSH6蛋白免疫组化检测。将石蜡切片依次烘片、脱蜡、水化，在柠檬酸盐缓冲液中微波处理10min，冷却后冲洗，3%H2O2中室温避光孵育10min；加入一抗室温孵育2h；漂洗后加入二抗室温孵育30min；滴加DAB，显微镜下观察5min，苏木精复染后流水冲洗30min，封片观察。每张病理切片均由至少两名高级职称病理医师阅片及判读结果。当有MLH1、PMS2、MSH2、MSH6任一蛋白表达缺失即为MMR蛋白表达缺失（Deficiency-MMR，dMMR），若4个蛋白均表达阳性则为MMR蛋白表达阳性（Proficient-MMR，pMMR）。

1.2.2 LS相关肿瘤个人史或家族史 147例EC患者均有详细的个人史和一级、二级亲属的LS相关肿瘤病史调查，包括结直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌等。患者根据MMR蛋白的免疫组化结果分为dMMR组与pMMR组。dMMR组均建议行胚系基因检测，pMMR组有LS相关肿瘤个人史或家族史者亦建议行胚系基因检测，如MMR蛋白表达阳性且无LS相关肿瘤个人史或家族史，考虑为散发性子宫内膜癌，不建议行基因检测。

1.2.3 胚系基因检测 本研究委托深圳华大临床检验中心，利用二代测序技术（NGS）结合目标区域捕获，对检测者相关基因（EPCAM、MLH1、MSH6、PMS2、MSH2、STK11、TP53、PTEN、MUTYH、BRCA1、MLH3）外显子及其邻近20个碱基对内含子区变异进行分析。根据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）的分类标准，将突变情况分为：致病性、疑似致病性、临床意义不明、可能良性、良性。本研究将已知或疑似致病突变统称为有害突变。

1.3 统计学方法 采用易侕统计学软件对数据进行统计分析。以NGS结果为确诊标准，比较IHC、LS相关肿瘤个人史或家族史在LS-EC初筛中的预测价值。采用受试者工作特性曲线（Receiver operator characteristic curve，ROC）综合对比两种筛查方法的准确性。ROC曲线下面积（Area under curve，AUC）用来综合评价诊断的准确性。AUC＞0.5时，越接近1表明诊断的准确性越高，0.8＜AUC≤0.9表示有较高的诊断价值，AUC＞0.9表示有很高的诊断价值。

2 结果

2.1 一般资料 147例EC患者发病年龄为30～75岁，平均53.46岁；诊断为LS患者平均年龄为49.6岁。病理类型包括子宫内膜样腺癌132例，浆液性癌4例，透明细胞癌2例，癌肉瘤1例，混合细胞腺癌7例，鳞状细胞癌1例；按照2009年FIGO分期：Ⅰ期129例，Ⅱ期7例，Ⅲ期10例，Ⅳ期1例。

2.2 免疫组化检查MMR蛋白表达结果 147例患者中46例（31.3%）患者为dMMR，101例（68.7%）患者为pMMR。46例dMMR患者的蛋白缺失表达情况：MLH1/PMS2联合缺失32例（21.8%），MSH2/MSH6联合缺失3例（2.0%），MSH6/MLH1/PMS2联合缺失2例（1.4%），单独MSH6蛋白缺失3例（2.0%），单独MLH1蛋白缺失3例（2.0%），单独PMS2蛋白缺失2例（1.4%），单独MSH2蛋白缺失1例（0.7%）。

2.3 LS相关肿瘤个人史或家族史 147例患者中有14例存在LS相关肿瘤个人史或家族史，其中10例为dMMR，4例为pMMR。10例dMMR患者均行NGS检测，其中7例确诊为LS。4例pMMR患者中3例行NGS检测，均无基因突变。

确诊为LS-EC且个人史或家族史阳性的7例患者中，存在LS相关肿瘤家族史6例，LS相关肿瘤个人史1例。6例家族史阳性患者中一级亲属患病5例，一级亲属合并二级亲属患病1例。家族史阳性患病人数：同一家族4人患病和3人患病各1例，2人患病4例。LS相关肿瘤分别为消化道恶性肿瘤5例，乳腺恶性肿瘤2例。见表1。

表1 LS-EC个人史、家族史阳性患者资料

2.4 林奇胚系基因检测结果 147例患者中43例行NGS检测，10例患者有致病突变或疑似致病突变，确诊为LS，LS-EC发生率为6.8%。突变基因分别为PMS2突变4例（9.3%），MSH2突变3例（7.0%），MSH6突变2例（4.7%），MLH1突变1例（2.3%）。已知致病突变6例，疑似致病突变4例。见表2。

按MMR蛋白表达情况送检NGS结果：dMMR组46例，行NGS检测40例，10例诊断为LS-EC；pMMR组101例，行NGS检测3例，均无基因突变，为散发性子宫内膜癌。

表2 LS-EC患者错配修复基因突变结果

2.5 不同筛查方法预测价值比较 147例患者中有LS相关肿瘤个人史或家族史患者14例，其中7例确诊为LS，敏感度为70.0%，特异性为94.9%，预测LS的AUC为0.82（见图1）；经IHC检测确定dMMR 46例，其中送检NGS 43例，最终10例确诊为LS，敏感度为100%，特异性为73.7%，预测LS的AUC为0.87（见图2）。LS相关肿瘤个人史或家族史联合MSH2/MSH6缺失预测LS的敏感度为70.0%，特异性为94.9%，AUC为0.83（见图3）。LS相关肿瘤个人史或家族史联合PMS2/MLH1缺失预测LS的敏感度为100%，特异性为76.6%，AUC为0.95（见图4）。

免疫组化检测为dMMR预测LS的敏感度最高，达100%；LS相关肿瘤个人史或家族史预测LS的特异性达94.9%，LS相关肿瘤个人史或家族史联合MSH2/MSH6缺失预测LS的特异性也达94.9%；LS相关肿瘤个人史或家族史联合PMS2/MLH1缺失预测LS的AUC最高，达0.95。

图1 LS相关肿瘤个人史或家族史预测LS

图2 dMMR预测LS

图3 LS相关肿瘤个人史或家族史联合MSH2/MSH6缺失预测LS

图4 LS相关肿瘤个人史或家族史联合PMS2/MLH1缺失预测LS

3 讨论

文献报道EC患者MMR基因突变率约为5.9%[3]。本研究147例EC患者中有43例行NGS检测，最终10例患者诊断为LS，LS-EC发生率为6.8%，略高于文献数据，考虑到本研究有6例dMMR患者未同意检测胚系突变，我们预测实际LS-EC发生率可能更高。国内LS相关子宫内膜癌筛查并未普及，我国人群中LS-EC患者的实际比例可能更高。研究显示，LS-EC患者的发病年龄普遍低于散发性EC患者[4]，发病年龄为46～54岁，小于50岁者占60%[5]。本研究中EC患者平均患病年龄为53.46岁，而10例诊断为LS患者平均患病年龄为49.6岁，低于散发性EC，与文献报道一致。

有研究报道，EC患者MMR蛋白表达缺失率为29.89%[6]；晋薇等[7]报道420例EC患者中MMR蛋白表达缺失率为34.5%；本研究IHC筛查结果显示dMMR发生率为31.3%（46/147），与相关文献报道基本一致。本研究MMR蛋白表达缺失率最高的为MLH1/PMS2联合缺失，发生率为21.8%（32/147）。MMR蛋白配对形成异二聚体，MLH1与PMS2配对，MSH2与MSH6配对，这些蛋白在不配对状态下是不稳定的，MLH1和MSH2可以与其他蛋白形成稳定的异二聚体，而PMS2和MSH6只能分别与MLH1和MSH2形成异二聚体[8]。当出现基因突变时，可能引起该基因对应的蛋白表达缺失，也可能出现配对基因的蛋白表达缺失。如MLH1突变可导致MLH1和PMS2的联合蛋白表达缺失，MSH2突变可导致MSH2和MSH6的联合蛋白表达缺失。但MSH6突变一般只引起对应的MSH6蛋白表达缺失，PMS2突变一般只引起对应的PMS2蛋白表达缺失。

EC患者MMR基因突变率最高的是MSH2基因，突变率为50%～66%，其次是MLH1（24%～40%）、MSH6（10%～13%），PMS2突变率最低（＜5%）[9]。本研究与文献报道不一致，10例LS基因突变率最高的是PMS2基因，4例PMS2突变有3例为疑似致病突变。相关研究报道，PMS2突变的EC患者中有27%被诊断为乳腺癌[10]。本研究中1例PMS2突变患者有姐姐及妹妹患乳腺癌家族史，故要关注PMS2基因突变患者继发第二种LS相关肿瘤的风险，尤其要重视乳腺癌筛查。

本研究中基因突变率居第二位的是MSH2，3例MSH2基因突变中有2例存在消化道恶性肿瘤家族史。其中1例患者发现子宫内膜癌时年龄30岁，且术前同时诊断结肠癌，其母亲在45岁和50岁时分别患子宫内膜癌和结肠癌。另1例患者35岁时发生子宫内膜癌，姐姐45岁时发生子宫内膜不典型增生，随后患直肠癌，家族中尚有2名二级亲属患结直肠癌。这两例MSH2基因突变患者的临床特点为：先证者发生LS相关肿瘤的年龄较小，分别为35岁和30岁；家族中有至少2人以上患病；LS相关肿瘤以子宫内膜癌和结直肠癌为主，先证者的首发肿瘤均为子宫内膜癌。这提示我们需高度重视年轻子宫内膜癌患者的遗传筛查，50%的情况下子宫内膜癌在结直肠癌诊断之前出现[1]，子宫内膜癌可作为患者自身和潜在家庭成员的前哨癌症，且为家族成员提供充足时间来筛查和预防LS相关的第二种肿瘤。对MSH2基因突变的患者应加强一级亲属的突变位点测序，绘制家系图，做好LS家系的长期风险管控和随访。

目前进行LS筛查的方法尚无统一定论。IHC检测快捷、价廉、相对可靠，是目前广泛接受的LS筛查方法。本研究中应用免疫组化检测出46例MMR蛋白表达缺失，最终确诊为LS-EC的10例患者均有MMR蛋白表达缺失，免疫组化检测的敏感度达100%，但特异性仅为73.7%。有LS相关肿瘤个人史或家族史患者14例，其中7例确诊为LS，特异性为94.9%。10例LS患者中有3例无家族史，因得益于免疫组化检测出dMMR进而行NGS检测筛查出LS，就筛查的敏感度而言，推荐MMR蛋白IHC检测作为LS的初筛手段。30例未诊断为LS的dMMR患者中有27例无家族史，NGS检测均无基因突变，提示临床筛查出dMMR患者时，临床医师应详尽地采集肿瘤家族史和个人史，并以LS相关肿瘤个人史或家族史作为分流手段，以提高筛查特异性。由于MMR蛋白表达缺失以MLH1/PMS2联合缺失发生率最高，LS相关肿瘤个人史或家族史联合PMS2/MLH1缺失预测LS的AUC为0.95，进一步证实联合筛查的预测效能最高。

综上所述，考虑筛查手段的可及性和成本效益，以IHC作为初筛手段，在dMMR人群中以个人史或家族史进行分流，可提高筛查特异性。MMR蛋白免疫组化检测联合LS相关肿瘤个人史或家族史是临床LS筛查的最优策略。