邱宇轩,廖 沙,张苏玥,杜欣键,张 丹,梁 峰

目前溃疡性结肠炎(UC)的治疗药物主要包括类固醇、免疫调节剂等，但临床疗效参差不齐，部分患者后期需要手术干预[1-2]。因此UC治疗新药的研发和应用具有重要意义。吲哚丙酸(IPA)是色氨酸经过肠道菌群代谢后的产物，研究发现其在抗癌[3]、预防糖尿病[4-6]、减轻中枢神经系统炎症反应[7]、预防辐射损伤[8]等方面均有作用。但IPA是否有防治UC的作用尚不清楚。核转录因子κB(NF-κB)在UC的发病过程中起关键作用，活化的NF-κB能促进下游炎性细胞因子基因的转录，进一步放大炎症级联效应。本研究采用葡聚糖硫酸钠(DSS)构建急性UC小鼠模型，通过小鼠疾病活动指数(DAI)、结肠组织病理评分、血清炎性指标、结肠组织炎性因子测定，探讨IPA对急性UC小鼠的防治作用；并通过检测NF-κB信号通路中关键分子NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白表达情况，探究IPA是否通过抑制NF-κB p65磷酸化而发挥对急性UC小鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：SPF级6～8周雄性C57BL/6小鼠60只[北京维通利华公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006]，体质量18～21 g。适应性饲养7 d,保证小鼠自由饮食、饮水，饲养环境温度(23±1)℃，相对湿度为50%～60%。

1.1.2主要试剂与仪器:IPA(美国sigma公司)，DSS(上海源叶科技有限公司)，髓过氧化物酶(MPO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国 abcam公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒、兔抗GAPDH单克隆抗体、兔抗NF-κB单克隆抗体、兔抗p-NF-κB单克隆抗体、兔二抗(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.2实验方法

1.2.1小鼠分组与处理:将小鼠随机分为对照组、DSS模型组(自由饮用3%DSS溶液7 d)和低、中、高剂量IPA组，每组12只。不同剂量IPA组(10、20、40 mg/kg)于DSS造模前2 d开始每日按各组剂量灌胃，直至处死小鼠。各组小鼠均在DSS造模第7日处死。

1.2.2一般情况和DAI:每日定时观察小鼠精神状态、体质量变化、粪便性状及便血情况等，根据体质量下降、大便性状和便血状况评定DAI,见表1。

表1 疾病活动指数评分标准

1.2.3结肠长度:处死小鼠后，打开腹腔，分离结肠系膜，获得盲肠至肛门全长，测量肛门至盲肠末端的长度。

1.2.4病理学评分:处死小鼠后，在距离肛门2 cm处取长约1 cm的结肠组织放于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋后行HE染色，光镜下观察并参照文献[9]行病理学评分。病理学评分为炎性浸润评分和组织损伤评分之和，炎性浸润评分：未见大量炎性细胞浸润计为0分，炎性细胞浸润局限于黏膜层计为1分，炎性细胞浸润黏膜下层计为2分，炎性细胞浸润肠壁全层计为3分；组织损伤评分：肠壁形态正常计为0分，散在的黏膜层损伤计为1分，黏膜层局灶性溃疡计为2分，广泛黏膜层损伤、深达黏膜下层计为3分。

1.2.5ELISA检测血清MPO：取各组小鼠外周血，根据ELISA试剂盒说明书测定MPO含量。

1.2.6ELISA检测结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO：制备各组小鼠结肠组织匀浆，通过BCA法测定各样本蛋白总量，再用对应的ELISA试剂盒测定各蛋白因子含量。

1.2.7Western blot法检测NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达：取各组小鼠结肠组织，加入蛋白裂解液，12 000×g离心20 min取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜，室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，置于二抗中室温孵育1 h。增强化学发光法显影后，采用Eblot凝胶成像系统照相并分析。

2 结果

2.1各组小鼠DAI、结肠长度及结肠组织病理学评分比较 与对照组比较，DSS模型组DAI、结肠组织病理学评分明显升高，结肠长度明显缩短(P<0.01)；与DSS模型组比较，中、高剂量IPA组小鼠DAI降低，IPA各剂量组结肠长度均增加、结肠组织病理学评分降低(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 各组小鼠DAI、结肠长度和病理学评分的影响

2.2各组小鼠结肠组织病理学表现 对照组结肠组织各层结构完整，基本无炎性细胞浸润。与对照组比较，DSS模型组在结肠组织各层均有大量炎性细胞浸润，主要为中性粒细胞和淋巴细胞，大部分黏膜结构消失，管壁结构不完整。与DSS模型组比较，IPA各剂量组炎性细胞浸润主要局限在黏膜层，上皮细胞大部分完整。见图1。

图1 各组小鼠结肠组织病理学表现(HE×100)

2.3各组小鼠血清MPO水平比较 血清MPO水平对照组为(160.91±23.08)pg/ml，DSS模型组为(350.82±22.53)pg/ml，低剂量IPA组为(288.11±36.49)pg/ml，中剂量IPA组为(252.33±56.31)pg/ml，高剂量IPA组为(267.55±44.15)pg/ml。DSS模型组MPO水平较对照组显著升高(P<0.05)。与DSS模型组比较，IPA各剂量组血清MPO水平均降低(P<0.05)。

2.4各组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO水平比较 DSS模型组结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO水平较对照组显著升高(P<0.01)。与DSS模型组比较，IPA各剂量组结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO水平均降低(P<0.05，P<0.01)。见表3。

表3 各组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO水平比较

2.5各组小鼠结肠组织NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白含量比较 与对照组比较，DSS模型组p-NF-κB p65/NF-κB p65比值显著升高(P<0.01);与DSS模型组比较，IPA各剂量组p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均显著降低(P<0.05)。见图2。

图2 Western blot检测各组小鼠结肠组织NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达

3 讨论

本研究发现IPA干预可降低DSS诱导急性UC小鼠模型DAI评分，说明IPA对急性UC小鼠的临床症状有明显改善作用。DSS造模成功后，小鼠结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明显升高。IL-1β是早期炎症反应标志物，能进一步引起IL-6、TNF-α等多种炎性因子产生[10]。大量TNF-α破坏细胞紧密连接，增加肠道上皮通透性，促进炎性肠病的发展[11]。而IL-6是单核巨噬细胞所产生的重要促炎细胞因子，可促进中性粒细胞向炎性部位浸润，并使下游转录激活因子3磷酸化，引起组织局部免疫功能失调[12]。本研究IPA各剂量组结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平明显降低，表明IPA可以通过抑制促炎细胞因子表达从而减轻结肠的炎症反应。MPO主要由中性粒细胞产生，可间接反映组织炎症严重程度[13]。本研究发现IPA能够降低DSS造模后小鼠血清及结肠组织MPO水平，说明IPA能一定程度减轻UC的局部和全身炎症反应。

从病理结果来看，DSS造模后小鼠结肠黏膜层完整性被破坏，部分肠道腺体消失，同时伴随以中性粒细胞和淋巴细胞为主的大量炎性细胞浸润，并可见隐窝脓肿出现。而当IPA干预后，小鼠结肠黏膜层结构基本恢复完整，炎性细胞浸润明显减少，与MPO减少的结果相一致，同时杯状细胞较DSS造模组明显增加。

NF-κB是参与炎症反应相关基因转录调控的核转录因子，p65和p50亚单位组成的异二聚体是其发挥作用的常见形式。p-NF-κB p65具有显著的促炎特性，可促进多种炎性因子基因的转录，在UC发病中起关键作用。本研究结果发现，IPA干预后p-NF-κB p65比例减低，表明IPA可抑制NF-κB信号通路中NF-κB p65的磷酸化，发挥其对UC的保护作用。

综上，IPA可降低DSS诱导急性UC小鼠结肠组织中炎性细胞因子含量，减少DSS造成的组织损伤，作用机制可能与抑制NF-κB p65磷酸化有关。